[发明专利]靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因及其构建的产物自动提纯的智能细菌表达系统和制备方法

权利要求书

1.一种靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因，其特征在于，所述融合基因包括磁小体膜蛋白基因的上游序列、靶蛋白基因、内含肽基因、磁小体膜蛋白基因和磁小体膜蛋白基因的下游序列，优选地，所述融合基因的结构为：磁小体膜蛋白基因的上游序列-纳米抗体基因-内含肽基因-磁小体膜蛋白基因-磁小体膜蛋白基因的下游序列；优选地，所述靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种权利要求1所述的靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因编码的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由靶蛋白、内含肽以及磁小体膜蛋白之间依次直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成；所述靶蛋白包括利用噬菌体展示技术获得的能够特异性识别抗原的纳米抗体，所述内含肽来自于嗜热菌；所述磁小体膜蛋白来自于趋磁细菌。

3.含有权利要求1所述靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因的生物材料，所述生物材料还包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌中的一种或多种。

4.一种智能细菌表达系统，其特征在于，所述智能细菌表达系统是在磁螺菌中整合靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因、表达裂解酶的基因和表达核酸酶的基因，所述裂解酶的基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述核酸酶的基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的智能细菌表达系统，其特征在于，所述智能细菌表达系统通过以下方法构建：(1)将所述靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因插入到自杀质粒的多克隆位点处得重组质粒1，(2)将重组质粒1转移至野生型磁螺菌中，制得重组磁螺菌；(3)将裂解酶基因以及核酸酶基因串联插入到穿梭质粒的多克隆位点处得重组质粒2；(4)将重组质粒2转移至所述重组磁螺菌中，得智能细菌表达系统。

6.如权利要求5所述的智能细菌表达系统，其特征在于，步骤(3)所述重组质粒2的制备方法如下：PCR扩增分别获得核酸酶基因和裂解酶基因，并分别插入到穿梭质粒中，制得重组质粒2，步骤(4)所述制备智能细菌的具体步骤为：将重组质粒2转化进供体菌株E.coliS17-1中，再将供体菌株E.coli S17-1胞内的重组质粒转化至步骤(2)制得的重组质粒1中，抗性筛选，得智能细菌表达系统。

7.靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物，其特征在于，所述靶蛋白-磁小体复合物是对权利要求4-6任一所述智能细菌表达系统进行培养，并从培养物中通过磁性吸附得到的。

8.利用权利要求4-6任一所述智能细菌表达系统制备的靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物，其特征在于，所述复合物的制备方法包括以下步骤：对智能细菌进行培养，离心收集细胞，在细胞自裂解后提取靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物。

9.利用权利要求8所述靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物纯化靶蛋白的方法，其特征在于，所述方法将靶蛋白-内含肽-磁小体免疫磁珠复合物重悬，30℃-50℃恒温孵育至靶蛋白释放。

10.应用权利要求4所述的智能细菌表达系统自动提纯四溴双酚A特异性纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A、智能细菌表达系统培养条件的确定：

1)将冻纯的智能细菌表达系统在乳酸钠普通培养基中连续活化两次；

2)对活化后的智能细菌表达系统进行培养；

3)在磁响应(Cmag值)最高时收集细胞，细胞自裂解后提取四溴双酚A纳米抗体-磁小体复合物，热诱导四溴双酚A纳米抗体的释放，ELISA检测四溴双酚A纳米抗体的功能；

B、纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物纯化条件的确定：

1)细胞重悬：按照1g菌泥：100μL缓冲液(10mM CaCl+10mM PBS pH 7.4)的比例重悬菌体(菌体刚好能重悬)；

2)破碎细胞：

滴加一滴氯仿于步骤1)中，震荡加速细胞的裂解；

3)纳米抗体-磁小体复合物的纯化：

将步骤2)制得的细胞破碎液用40mL的PBS(pH 7.4)重悬后，静置在强力磁铁上(4℃)，待复合物已被吸附至容器底部后，测定上清的OD₂₆₀和OD₂₈₀值，弃上清，用等体积的PBS重悬沉淀，重复磁铁吸附的过程，待上清OD₂₆₀和OD₂₈₀低于0.05时，说明复合物已经纯化好。

4)纳米抗体的收集：

将步骤3)中的复合物用PBS重悬，40℃恒温孵育至四溴双酚A纳米抗体的释放，ELISA检测。