[发明专利]靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因及其构建的产物自动提纯的智能细菌表达系统和制备方法

说明书

本发明提供了一种靶蛋白‑内含肽‑磁小体融合蛋白及其构建的产物自动提纯的智能细菌和制备方法，其中，融合蛋白是由靶蛋白、内含肽以及磁小体膜蛋白之间直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成；本发明还提供了一种靶蛋白‑内含肽‑磁小体融合基因，融合基因包括磁小体膜蛋白基因的上游序列、纳米抗体基因、内含肽基因、磁小体膜蛋白基因和磁小体膜蛋白基因的下游序列；本发明还提供了通过靶蛋白‑内含肽‑磁小体融合基因构建的产物自动提纯的智能细菌；本发明的智能细菌较传统原核生物表达系统具有靶蛋白提纯条件温和、无需外加试剂、成本低、操作简单、纯度高，且对靶蛋白的产量等影响小。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因及其构建的产物自动提纯的智能细菌表达系统和制备方法。

背景技术

细菌具有代时短、可高密度生产、培养基成分简单等特点，使其成为无需转录或翻译后修饰的简单异源基因表达的首选。大肠杆菌除了具备细菌一般的特点，因其遗传学背景最为清晰，易于操作，是实验室以及工业生产中最为青睐的。蛋白异源表达是为了获得高产量有功能的蛋白产物，这就要求首先将细胞破碎释放出靶蛋白，接着从细胞碎片中筛选出靶蛋白。细胞破碎有物理、化学以及酶法，典型的蛋白纯化涉及各种层析等多步骤。实际生产中，需要对各步骤的工艺条件进行摸索，每一次的条件摸索都不可避免的会导致蛋白产量降低、活性降低或功能的破坏。也就是说，步骤越繁杂，对蛋白造成的破坏会越严重。报道显示，在工业和药用蛋白的大规模生产中，后续蛋白纯化产生的费用高达整个工艺流程产生费用的80％。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种靶蛋白-内含肽-磁小体融合蛋白及其构建的产物自动提纯的智能细菌表达系统和制备方法。首先以同源双交换的方法将靶蛋白基因整合到宿主菌(磁螺菌)的基因组上，选择的锚定蛋白为MamC；其次，将裂解酶基因以及核酸酶基因游离表达在上述重组菌株的基因组外。本方法首次以宿主菌合成的磁颗粒为载体并且全程利用宿主菌自身的工程酶绿色提纯外源靶蛋白。

本发明提供了一种靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因，融合基因包括磁小体膜蛋白基因的上游序列、靶蛋白基因、内含肽基因、磁小体膜蛋白基因和磁小体膜蛋白基因的下游序列，融合基因的结构如下：磁小体膜蛋白基因的上游序列-纳米抗体基因-内含肽基因-磁小体膜蛋白基因-磁小体膜蛋白基因的下游序列。

其中，磁小体膜蛋白基因的上游序列如SEQ ID NO:7所示，磁小体膜蛋白基因的下游序列如SEQ ID NO:8所示

优选地，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了一种编码靶蛋白-内含肽-磁小体融合基因的融合蛋白，该融合蛋白是由靶蛋白、内含肽以及磁小体膜蛋白之间依次直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成。

其中，靶蛋白包括利用噬菌体展示技术获得的能够特异性识别抗原的纳米抗体。内含肽来自嗜热菌(Pyrococcus abyssi)的某段内含肽序列，序列来源是公开的嗜热菌基因数据库。磁小体膜蛋白来自于趋磁细菌。

优选地，纳米抗体为四溴双酚A特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码纳米抗体的基因序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，内含肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，编码内含肽的基因序列如SEQID NO:5所示。

优选地，磁小体膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码膜蛋白的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，纳米抗体-内含肽-磁小体融合蛋白为四溴双酚A特异性纳米抗体-内含肽-磁小体膜蛋白的融合蛋白。也可将融合蛋白中的四溴双酚A特异性纳米抗体替换成其他靶蛋白。