[发明专利]合浦珠母贝外套膜细胞体外培养液、制备方法及使用方法

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，公开了一种合浦珠母贝外套膜细胞体外培养液、制备方法及使用方法，其中细胞体外培养液包括以下组分：基础细胞培养基、茶多酚、胎牛血清、珍珠贝体液、卡那霉素、平衡盐溶液、葡萄糖。本发明通过在基础细胞培养基中添加中草药提取物茶多酚、珍珠贝体液及其他组分，以合理的配比来实现抑菌、抗氧化和抗细胞衰老的目的，具有无毒副作用，不易对环境造成污染，且无残留；不仅提高了外套膜细胞培养的成活率，降低操作成本，降低了操作难度，而且突破了外套膜细胞体外培养的瓶颈。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种合浦珠母贝外套膜细胞体外培养液、制备方法及使用方法。

背景技术

合浦珠母贝(Pinctada fucata)又称马氏珠母贝(Pinctada martensii)，在动物分类学地位上隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、珍珠贝目(Pterioida)、珍珠贝科(Pteriidate)、珠母贝属(Pinctada)，是世界上生产海水珍珠的主要贝种，也是我国生产海水养殖珍珠“南珠”的主要贝类之一。合浦珠母贝主要分布在热带和亚热带海域，在我国主要分布在海南、广东、广西、台湾等省沿海；在国外分布于太平洋西岸濒海地国家，从日本千叶县以南至菲律宾、越南、缅甸、印度尼西亚、斯里兰卡、澳大利亚等均有分布。自1965年我国成功地开展合浦珠母贝人工育苗和插核育珠关键技术的科学研究以来，促进了我国海水珍珠养殖的迅速发展。进入80年代，我国已成为世界海水珍珠养殖大国，合浦珠母贝培育的珍珠也成为我国海水珍珠的主要养殖贝种，也是海南、广东、广西发展海洋经济的支柱产业之一。近年来我国的海水珍珠在产量提高的同时，珍珠的质量却在明显的下降，这使得我国海水珍珠在国际珍珠市场上的竞争力逐渐降低。同时在生产养殖上表现出合浦珠母贝种质退化，育珠贝越来越小，病害严重，育珠贝插核后的死亡率和吐核率增加，优质珠率下降，而薄层珠、污珠、畸形珠、小型珠率高。导致该现象的原因除了养殖技术落后、管理不科学、养殖密度过大和养殖环境污染外，还与插核技术的局限性有关。

目前，合浦珠母贝插核育珠技术主要采取移植入细胞小片(外套膜细胞小片)和珠核的方法进行插核育珠，而外套膜细胞小片分泌珍珠质形成珍珠则起着重要作用，同时制作细胞小片的大小、形状、切取位置及植入细胞小片贴附于珠核的位置等因素均影响生产珍珠的质量。介于外套膜细胞分泌形成珍珠质的过程中起着重要作用，研究合浦珠母贝外套膜细胞体外培养与移植培育珍珠已成为科学工作者的研究方向，而贝类的外套膜细胞培养作为至关重要的一环成为当前研究的热点。在外套膜细胞体外培养的过程中，细胞往往会过早进入衰退阶段，导致后续操作无法完成。

迄今为止，采用中草药成分来改善细胞体外培养成活率的研究还未见报道。因此，探究一种提高贝类外套膜细胞体外培养的成活率的培养液，对珍珠贝类产业的可持续发展和集约化生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供了一种提高外套膜细胞培养成活率，实现抑菌、抗氧化和抗细胞衰老的目的合浦珠母贝外套膜细胞体外培养液。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种合浦珠母贝外套膜细胞体外培养液，包括以下组分：基础细胞培养基、茶多酚、胎牛血清、珍珠贝体液、卡那霉素、平衡盐溶液、葡萄糖。

进一步地，上述各组分添加量分别为：基础细胞培养基200～300ml/L、茶多酚1.5～2.0ml/L、胎牛血清2.5～4.0ml/L、珍珠贝体液2.0～3.0ml/L、卡那霉素0.05～0.08g/L、平衡盐溶液200～350ml/L、葡萄糖100～200ml/L。

进一步地，所述基础细胞培养基采用TC199细胞培养基。

进一步地，所述珍珠贝体液的获取方法：将生长状况良好的合浦珠母贝外壳清洗干净并擦拭75％酒精，放置阴凉处，待酒精挥发后，在无菌操作台内打开外壳获取初始珍珠贝体液，将初始珍珠贝体液、0.5ppm的高锰酸钾溶液和无菌蒸馏水混合，得到珍珠贝体液。