[发明专利]一种用于二代测序文库构建方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于二代测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：提取需要测序的基因组DNA，包含但不限于各种肿瘤组织DNA，或外周血游离DNA(孕妇外周血或正常人或肿瘤患者外周血DNA)或各种体液，如但不限于胸腔积水、尿液，唾液等中的DNA。

步骤2：设计包含特异目标序列引物的，同时带有样本标记序列(index)和测序引物的引物序列，并人工合成该引物；

步骤3：将所述特异性引物和待测DNA混合，进行PCR扩增；

步骤4：纯化PCR产物；

步骤5：上机测序；

其中步骤2中使用的引物序列还包括SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头，所述SEQ ID NO:1(A+B)：5'-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(X1)m-3'，所述SEQ ID NO:2(D+E+F)：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(N)n(X2)m-3'；

其中所述SEQ ID NO:1(A+B)中(X1)m被设计成与被检测的目标序列位点附近上游引物；所述SEQ ID NO:2(D+E+F)中(N)n为标签序列，用于区分来自不同样本的测序数据，n为6～12的正整数，n个N彼此独立地选自A、T、C、G，(X2)m为下游引物，m为20-40的正整数，距离该位点1～50bp，例如2～20bp的目标序列特异性引物。

2.根据权利要求1所述的一种用于二代测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤3中PCR反应体系为DNA20ul、PCR引物混合物5ul和PCR主混合物25ul。

3.根据权利要求1所述的一种用于二代测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤4中对产物进行纯化的步骤，可以采用本领域熟知的磁珠法或滤膜吸附法试剂盒。

4.根据权利要求1所述的一种用于二代测序文库的试剂盒，其特征在于：所述上下游引物具体可以是，但不限于核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物。

5.根据权利要求4所述的一种用于二代测序文库的试剂盒，其特征在于：还包括以下试剂：Taq酶，DNTP，MgCl₂和PCR缓冲液。

6.根据权利要求4-5所述的一种用于二代测序文库的试剂盒，其特征在于：还包括磁珠法DNA纯化试剂盒或滤膜吸附法DNA纯化试剂盒。