[发明专利]一种用于二代测序文库构建方法及试剂盒

说明书

本发明公开了核酸测序领域的一种用于二代测序文库构建方法及试剂盒，包括步骤1：提取需要测序的基因组DNA，包含但不限于各种肿瘤组织DNA，或外周血游离DNA或各种体液，如但不限于胸腔积水、尿液，唾液等中的DNA，步骤2：设计包含特异目标序列引物的，同时带有样本标记序列(index)和测序引物的引物序列，并人工合成该引物；步骤3：将所述特异性引物和待测DNA混合，进行PCR扩增；步骤4：纯化PCR产物；步骤5：上机测序，该用于二代测序文库构建方法及试剂盒简化了建库流程，降低建库成本，提高了检测的灵敏度，也降低了检测所需测序的数据量，有效去除假阳性、提高目标DNA片段富集效率且减少测序数据浪费。

技术领域

本发明涉及核酸测序领域，具体为一种用于二代测序文库构建方法及试剂盒。

背景技术

基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。在病原体检测、肿瘤突变基因检测、孕妇血浆中存在胎儿游离DNA的检测中，需要在大量的正常基因序列中发现少量的突变基因，这时候，二代测序以其高通量测序的特点，就能够发挥出优异的特点，以远低于一代测序(Sanger测序) 的成本检测出样本中少量的(低于1％)突变基因，例如癌症患者血浆中存在肿瘤特征的游离DNA(ctDNA)、癌组织样本(如FFPE)中存在比例较低的亚克隆突变和孕妇血浆中存在胎儿游离DNA，以及艾滋病、肝炎等患者血浆中存在病毒DNA。

但是常规二代测序方法的测序文库的构建过程比较复杂，包括基因组的片段化、DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，再将3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物等步骤，期间还要经过多步的纯化，模版DNA损失很多，非常不利于低频率的基因突变检测。如果还要增加对目标片段的捕获步骤，检测的准确性更加难以保证，实践中常常需要加大测序深度，极大增加测序成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于二代测序文库构建方法及试剂盒，以解决上述背景技术中提出模版DNA损失很多，非常不利于低频率的基因突变检测，检测的准确性更加难以保证，增加测序成本的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于二代测序文库构建方法，包括如下步骤：

步骤1：提取需要测序的基因组DNA，包含但不限于各种肿瘤组织DNA，或外周血游离DNA(孕妇外周血或正常人或肿瘤患者外周血DNA)或各种体液，如但不限于胸腔积水、尿液，唾液等中的DNA。

步骤2：设计包含特异目标序列引物的，同时带有样本标记序列(index) 和测序引物的引物序列，并人工合成该引物；

步骤3：将所述特异性引物和待测DNA混合，进行PCR扩增；

步骤4：纯化PCR产物；

步骤5：上机测序；

其中步骤2中使用的引物序列还包括SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头，所述SEQ ID NO:1(A+B)：5'-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(X1)m-3'，所述 SEQ ID NO:2(D+E+F)：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(N)n(X2)m-3'；

其中所述SEQ ID NO:1(A+B)中(X1)m被设计成与被检测的目标序列位点附近上游引物；所述SEQ ID NO:2(D+E+F)中(N)n为标签序列，用于区分来自不同样本的测序数据，n为6～12的正整数，n个N彼此独立地选自A、 T、C、G，(X2)m为下游引物，m为20-40的正整数，距离该位点1～50bp，例如2～20bp的目标序列特异性引物。

优选的，所述步骤3中PCR反应体系为DNA20ul、PCR引物混合物5ul和 PCR主混合物25ul。