[发明专利]一种三酶共表达重组菌及其在(S)-香茅醇合成中的应用

权利要求书

1.一种三酶共表达重组菌，其特征在于所述共表达重组菌是将老黄酶NemR-PS编码基因、醇脱氢酶YsADH编码基因和葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6编码基因共同导入宿主细胞构建而成；所述老黄酶NemR-PS编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，醇脱氢酶YsADH编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.如权利要求1所述三酶共表达重组菌，其特征在于所述共表达重组菌按如下方法构建：将所述醇脱氢酶YsADH编码基因插入pACYCDuet-1载体上的第一克隆位点Nco I和HindIII之间，将所述老黄酶NemR-PS编码基因插入pACYCDUet-1载体上的第二克隆位点Nde I和Xho I之间，得到第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS；将所述葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6编码基因插入载体pET28b上的EcoR I和Hind III之间，得到第二重组载体pET28b-BmGDH_M6；将第一重组载体pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS；然后将第二重组载体pET28b-BmGDH_M6导入重组菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS感受态细胞中，得到所述的共表达重组菌。

3.一种权利要求1所述三酶共表达重组菌在还原(E/Z)-柠檬醛合成(S)-香茅醇中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：以共表达重组菌经诱导表达获得的湿菌体为催化剂，以(E/Z)-柠檬醛为底物，以葡萄糖为辅底物，加入助溶剂和/或辅酶NADP⁺，以pH 5.0～9.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20～45℃、0～700rpm条件下转化反应12～48h，获得含(S)-香茅醇的反应液，反应液分离纯化，获得(S)-香茅醇；所述助溶剂为1-丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇或二甲基亚砜。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述转化体系中，催化剂加入量以转化体系体积计为10～100g/L；底物加入终浓度以转化体系体积计为50～400mM；所述葡萄糖加入终浓度为底物加入浓度的3倍；所述NADP⁺加入终浓度以转化体系体积计为0～1.0mM；所述助溶剂体积加入量以转化体系体积计为10～40％。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于在反应过程中，补加含葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6编码基因的工程菌诱导培养的湿菌体。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于湿菌体的补加量以转化体系体积计为20～80g/L，补加的时间点为反应进程的12h、24h或者36h。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述共表达重组菌的湿菌体按如下方法制备：将共表达重组菌接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm下培养过夜，然后培养液以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在23℃下诱导培养12h，获得诱导培养液；再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。