[发明专利]一种三酶共表达重组菌及其在(S)-香茅醇合成中的应用

说明书

本发明公开了一种三酶共表达重组菌及其合成(S)‑香茅醛中的应用，所述重组菌是将老黄酶NemR‑PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6的编码基因共同导入宿主细胞构建而成。本发明利用共表达老黄酶NemR‑PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6的重组菌一锅法级联催化400mM(E/Z)‑柠檬醛的二步还原，反应24h补加表达葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6重组菌湿菌体，反应36h后底物完全转化为产物(S)‑香茅醇，产物e.e.值99％，化学选择性和对映体选择性高；方法绿色高效，条件温和，操作简单，适合大规模工业生产。

(一)技术领域

本发明属于生物催化领域，涉及一种老黄酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢共表达重组菌及其在整细胞催化选择性还原(E/Z)-柠檬醛合成(S)-香茅醇中的应用。

(二)背景技术

香茅醇作为一种重要的香料原料，常用于配制玫瑰香型、柑桔香型的香料和高档香水。香茅醇同时也是一种重要的食用型香料，用于制作鲜花饼、烘焙食品、饮料和糖果等食物。香茅醇还具有药用价值，包括体外的抗细菌和抗真菌作用，以及体内的止痛和抗惊厥作用。(S)-香茅醇还是手性合成中的重要中间体，可用于合成全顺式的玫瑰醚，该化合物香气幽雅。

香茅醇和(S)-香茅醇的合成方法包括化学法和生物法。化学法以香叶醇、柠檬醛或者香茅醛为底物，通过加氢合成香茅醇。在诸多底物中，柠檬醛作为大宗化学品，更具价格优势。然而，化学法选择性还原柠檬醛合成香茅醇仍极具挑战。这是因为柠檬醛含有两个C＝C和一个C＝O基团，化学还原会生成香茅醛、香茅醛、橙花醇、香叶醇以及3,7-二甲基辛醇等产物，副产物众多。此外，大宗柠檬醛是(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的混合物，而(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛的还原产物往往光学性质是互补的，因而产物的光学纯化不高。与化学法相比，生物法中的酶具有高化学选择性和高对映体选择性，是替代化学法的理性选择。然而，目前生物法合成香茅醇的报道并不多。2011年，马来西亚大学报道了在连续密闭气体循环生物反应器中，利用酿酒酵母(贝克酵母II型)静息细胞将香叶醇生物转化为香茅醇。2021年，GuozhenJiang等人利用代谢工程技术构建了一种重组酿酒酵母，该酵母在分批发酵中香茅醇产量可达8.30g/L。

与已有的生物法不同，我们基于多酶级联催化(E/Z)-柠檬醛两步还原生成(S)-香茅醇：老黄酶不对称还原E/Z)-柠檬醛生成(S)-香茅醛，醇脱氢酶催化(S)-香茅醛的进一步还原生成(S)-香茅醛，葡萄糖脱氢酶则起到驱动辅酶循环的作用。对于多酶催化体系，通过多酶共表达构建整细胞催化剂，构建一锅法催化工艺，可以简化催化剂的制备，避免细胞与细胞之间的跨膜屏障，有利于酶的稳定性，有助于提高催化效率。具体地，我们选择了源自斯氏普罗威登斯菌Providencia stuartii具有高活力和严格(S)-对映体选择性的老黄酶NemR-PS、取源自约克氏菌Yokenella sp.WZY002高活力热稳定性好的醇脱氢酶YsADH和源自巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium底物耐受性强葡萄糖脱氢酶突变子BmGDH_M6来构建共表达该三酶的重组菌菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-YsADH-NemR-PS/pET28b-BmGDH_M6，以该重组菌为整细胞催化剂，实现了高效选择性还原(E/Z)-柠檬醛生成(S)-香茅醇。目前，尚未见共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6的构建报道，也未见利用共表达老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6重组菌两步还原(E/Z)-柠檬醛生成(S)-香茅醇的报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种三酶共表达重组菌以及利用所构建的重组菌催化(E/Z)-柠檬醛的还原生成(S)-香茅醇的新方法，所述三酶为老黄酶NemR-PS、醇脱氢酶YsADH和葡萄糖脱氢酶BmGDH_M6，该方法具有高效、化学选择性和对映体选择性专一、绿色环保、条件温和等优点，避免了化学法中常见的选择性低、条件苛刻、副产物多等问题。