[发明专利]基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法

权利要求书

1.基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，方法步骤如下：

步骤1：提取cfDNA；

步骤2：将cfDNA片段进行末端修复并补齐；

步骤3：将末端补齐的DNA与测序接头进行连接，得到连接产物；

步骤4：通过葡糖基转移酶T4-β-GT，将含叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose的修饰基团转移到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；

步骤5：在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin；

步骤6：将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；

步骤7：利用缓冲液多次洗涤所述固相材料去除未结合的DNA片段；

步骤8：以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的DNA为模板，进行PCR扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；

步骤9：对测序文库进行质量检查；

步骤10：将含有不同barcode的文库按相同摩尔浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序，获得测序结果；

步骤11：5hmC生物标志物的选择和模型构建；

步骤12：数据分析。

2.根据权利要求1所述的基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，在步骤2中，首先将提取的cfDNA进行片段长度检测；再将筛选的cfDNA进行末端修复并补齐。

3.根据权利要求1所述的基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，在步骤5中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素。

4.根据权利要求1所述的基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，在步骤6中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。

5.根据权利要求1所述的基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，其特征在于，在步骤7中，所述缓冲液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl和表面活性剂Tween20。