[发明专利]基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法

说明书

本发明涉及肺癌检测技术领域，尤其涉及基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法。本发明使用靶向捕获技术进行5hmC高通量测序的检测方法，通过机器学习相关算法，实现通过对ctDNA多表观遗传组学进行免疫检查位点抑制剂响应的预测。这种无创、实时的检测方法将为免疫检查位点抑制剂的应答提供重要分子靶标，便于后续的研究、诊断。

技术领域

本发明涉及肺癌检测技术领域，尤其涉及基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法。

背景技术

目前，使用的生物标志物主要有PD-L1的表达量以及肿瘤突变负荷(TMB)。前者是使用免疫组化检测组织样本的PD-L1蛋白表达，但是这个评估指标并不是绝对的，PD-L1阳性的癌症病人对PD-1药物的应答率是36％-100％，但是PD-L1阴性的癌症病人也有对治疗产生应答的，应答率是0％-17％。但是PD-L1表达阳性的标准难以界定，而且有时PD-L1不仅在癌细胞表达，也在围绕病灶的微环境中的非癌细胞表达，这势必会造成一定的干扰。最后一点是，PD-L1检测，仅适用于PD-1或PD-L1药物的预测，对于其他免疫药物的疗效预测则无能为力。

TMB是肿瘤组织每兆碱基中突变的数目，一般这个指标是通过组织样本进行检测的，目前也有基于血液来源的TMB(bTMB)进行检测的。肿瘤突变负荷(TMB)作为一个潜在的生物标志物而出现。在不同的癌症中体细胞突变的数量从0.01突变/Mb到超过400突变/Mb不等。而这些突变中有些会转录表达多肽抗原表位或肿瘤新抗原。早期关于TMB的研究都是采用全外显子(WES)测序方法对肿瘤DNA和对照的胚系DNA进行分析。虽然TMB目前已被FDA批准用于免疫检查位点抑制剂指导用药，但其依然存在很多缺陷，如随着检测平台不同，所检测的基因panel不同，会导致Cut-off值出现差异，不同的算法也会影响TMB的预测值，因为算法在不同的基因检测panel中差异非常大，并且用于评估TMB的突变类型在各种检测方法中也有所差异。在很多采用WES的分析中，TMB只包含错义突变，而没有纳入其他突变类型。特别是，在福尔马林固定石蜡包埋样品处理方法的不同也能够很大程度上影响TMB的值10。此外，不同的算法也会影响TMB的预测值，因为算法在不同的基因检测panel中差异非常大，并且用于评估TMB的突变类型在各种检测方法中也有所差异。在很多采用WES的分析中，TMB只包含错义突变，而没有纳入其他突变类型。特别是，在福尔马林固定石蜡包埋样品处理方法的不同也能够很大程度上影响TMB的值10。

DNA的表观遗传修饰与肿瘤的发生、发展密切相关，肿瘤与健康人的DNA表观修饰不同，不同类型肿瘤的DNA表观修饰也不同，同类型肿瘤不同时期也差别很大。cfDNA是细胞释放到血液循环系统的DNA片段，来自与肿瘤的cfDNA称为ctDNA，这些片段保留了肿瘤DNA表观遗传修饰等信息。理论上，通过液体活检技术检测cfDNA表观遗传修饰能够用于免疫检查位点抑制剂的应答效率预测。

随着免疫治疗研究进展及免疫抑制剂的临床应用，免疫检查位点抑制剂在很大程度上改变了非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗方式。包含PD-1/PD-L1、CTLA4的免疫治疗是肿瘤治疗的趋势所在，但并不是所有的肿瘤患者都适合免疫治疗，研究显示，在非小细胞肺癌中，PD-1单药的应答效率只有25％左右，因此如何使用合适的肿瘤标准物来预测PD-1等免疫检查位点抑制剂的响应是一个急需解决的问题。

发明内容

针对背景技术中存在的需要合适的肿瘤标准物来预测PD-1等免疫检查位点抑制剂的响应问题，提出基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法。本发明使用靶向捕获技术进行5hmC高通量测序的检测方法，通过机器学习相关算法，实现通过对ctDNA多表观遗传组学进行免疫检查位点抑制剂响应的预测。这种无创、实时的检测方法将为免疫检查位点抑制剂的应答提供重要分子靶标，便于后续的研究、诊断。

本发明提出基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法，方法步骤如下：

步骤1：提取cfDNA；

步骤2：将cfDNA片段进行末端修复并补齐；