[发明专利]pSFVCs-EGFP和pSFV-EGFP病毒样颗粒及其制备方法、应用

说明书

本发明公开了一种pSFVCs‑EGFP病毒样颗粒及其制备方法，包括：设计与合成引物：构建得到复制子质粒pSFVCs‑sp6‑EGFP；将复制子质粒pSFVCs‑sp6‑EGFP进行体外转录；再将其体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到pSFVCs‑EGFP病毒样颗粒。相应的，本发明在pSFVCs‑EGFP病毒样颗粒基础上构建了去除病毒衣壳蛋白结构的复制子质粒pSFV‑sp6‑EGFP，进而制备出病毒样颗粒pSFV‑EGFP。实施本发明，所述病毒样颗粒pSFV‑EGFP增强了EGFP蛋白的表达，成功建立了一种以塞姆利基森林病毒为载体高效表达其它重要外源蛋白的平台，为后续RNA疫苗研制奠定实验基础。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种pSFVCs-EGFP和pSFV-EGFP 病毒样颗粒及其制备方法、应用。

背景技术

RNA复制子是衍生于RNA病毒基因组并能自主复制的RNA。最常用于开发复制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒(Alphavirus),如辛德比斯病毒 (Sindbis virus,SIN)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus,VEE)；除甲病毒外，还有黄病毒、小RNA病毒、副粘病毒、杯状病毒等。被改造用于RNA复制子疫苗的载体。本发明基于甲病毒载体，甲病毒是单股正链RNA病毒，SFV和SIN 的基因组约12kb，由两个开放读码框架(ORF)组成，靠近5末端的前2/3部分编码非结构蛋白，称为非结构区，该区共编码4种非结构蛋白(nspl—nsp4)；靠近3末端的后1/3部分称为结构区，编码数种结构蛋白，包括衣壳蛋白(C)，膜糖蛋白El、E2、E3以及6K蛋白等。在感染过程中5末端2/3的基因组 RNA首先翻译，产生RNA复制和转录所需要的nSPs。然后在nSPs的作用下，以基因组RNA为模板合成负链，再以负链为模板合成新的基因组RNA分子。结构蛋白由亚基因组mRNA翻译到，亚基因组mRNA沉降系数为26S，因此该亚基因组的启动子命名为P26s。基因组RNA复制得到负链RNA后，由亚基因组启动子P26s启动亚基因组mRNA的转录,并在翻译的同时或之后经病毒和宿主编码蛋白酶的联合作用下而裂解为衣壳蛋白和膜糖蛋白。结构蛋白与先前合成的基因组RNA装配成核衣壳后以出芽方式释放。甲病毒的特点使其可以作为一种基因转移的载体。RNA复制子载体包含病毒基因组3末端的非编码区和非结构蛋白基因编码区，去掉了其结构区，而引入了多克隆位点。在该处插入外源基因之后，可以由26s启动子启动亚基因组mRNA 控制表达。

表达抗原的RNA复制子可由3种方式递送:(1)体外转录的裸RNA；(2) 构建成质粒DNA由细胞RNA聚合酶Ⅱ体内转录成复制子RNA(基于DNA)；(3)将复制子RNA包装入病毒样颗粒。裸RNA 存在不稳定、降解快、不易储存等缺点,而病毒样颗粒没有感染性,作为免疫原,它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应,成为良好的疫苗；作为基因治疗载体,可以插入外源蛋白的表位,通过释放外源蛋白达到特异性治疗的目的；由于在细胞表面存在相应受体,既可提高其稳定性还可以增加效率而倍受关注。与其他表达载体相比,SFV复制子表达系统具有宿主范围广、表达效率高等优点，已被广泛用于表达外源基因和构建复制子疫苗以及基因治疗导向载体制备等领域，尤其是在疫苗研究方面，已有病毒和肿瘤复制子候选疫苗进入临床前期及临床试验，显示了其应用前景。

本发明以塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)为载体，它包括两个独立的RNA分子,一个RNA分子是包含插入了EGFP荧光蛋白基因的RNA 复制子载体。另一个RNA分子是辅助RNA。增强EGFP蛋白的表达，为后续其他重要外源蛋白的筛选和RNA疫苗研制能够提供可靠的实验基础和科学依据，具有重大的意义。然而，如何提高以塞姆利基森林病毒为载体的EGFP蛋白的表达，目前尚未文献记载。

发明内容