[发明专利]一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法

权利要求书

1.一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法，所述方法，步骤如下

步骤1，紫花苜蓿种子的清洗

取紫花苜蓿种子，经消毒处理，养育4-5天，长出幼根；

步骤2，紫花苜蓿幼根的预处理

将养育好的紫花苜蓿幼根浸泡在CPW溶液，浸泡1-2个小时；

步骤3，酶解

取浸泡后紫花苜蓿幼根加入酶解液进行酶解，酶解时间为4-8小时；

步骤4，分离

酶解液过滤，离心分离得到原生质体。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤如下：

步骤1，紫花苜蓿种子的清洗

取生长4-5天在MS固体培养基无菌处理过的紫花苜蓿幼根，利用20％次氯酸钠，75％乙醇对紫花苜蓿种子消毒处理，再用蒸馏水清洗五次，将100目的尼龙纱布平铺在MS固体培养基上，将紫花苜蓿种子铺在尼龙纱布上养育4-5天；

步骤2，紫花苜蓿幼根的预处理

将配制好的含有13％甘露醇的CPW溶液放在冰上，取步骤1的紫花苜蓿幼根1-2g置于CPW溶液当中浸泡1-2个小时；

步骤3，酶解

取浸泡后紫花苜蓿幼根加入酶解液进行酶解，所述酶解液含有以下成份：2％纤维素酶、1％果胶酶、0.4％离析酶、0.5M甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mMCaCl2、0.1％BSA，

酶解液使用前需要过滤，过滤采用0.22μm混合纤维素滤膜过滤，酶解在抽真空30min后，在50rpm/min，25℃避光条件下进行，酶解时间为4-8小时；

步骤4，分离

利用40μmFalcon 50细胞过滤器过滤掉酶解后的残渣，上清置于50ml离心管里，利用300g离心力在4℃条件下离心5min，弃掉上清液后，使用含有8％甘露醇溶液清洗Ca²⁺和Mg²⁺，使细胞重悬，离心，再重悬，再离心，获得原生质体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述MS固体培养基：由MurashigeSkoog、蔗糖、琼脂所配制的培养基。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述MurashigeSkoog配方如下：

。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述固体培养基配方如下：

蔗糖	8.02g
MurashigeSkoog	4.446g
琼脂	8g
加水到	1L
调节PH到	5.7-5.85

。