[发明专利]一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体的提取方法

说明书

本发明涉及一种用于紫花苜蓿根部单细胞转录组测序的原生质体悬浮液制备方法，所述方法，步骤如下：步骤1，紫花苜蓿种子的清洗，取紫花苜蓿种子，经消毒处理，养育4‑5天，长出幼根；步骤2，紫花苜蓿幼根的预处理，将养育好的紫花苜蓿幼根浸泡在CPW溶液，浸泡1‑2个小时；步骤3，酶解，取浸泡后紫花苜蓿幼根加入酶解液进行酶解，酶解时间为4‑8小时；步骤4，分离，酶解液过滤，离心分离得到原生质体。

技术领域

本发明涉及植物原生质体的提取方法，特别涉及一种紫花苜蓿根部原生质体的提取方法。

背景技术

脱去细胞壁的细胞叫原生质体，植物原生质体常常用于DNA转化，因为细胞壁会阻止DNA进入细胞。除了在DNA和蛋白质转染中使用外，原生质体还用于再生整个植物，原生质体融合制备杂交体，膜片钳实验等。原生质体可用于研究生物膜，包括高分子和病毒的摄取。也用于体细胞的变异克隆。使用原生质体融合技术可让原生质体也用于植物育种。此外，在某些细胞中表达荧光蛋白的植物的原生质体可用于荧光活化细胞分选(FACS)，方便保留特定波长发荧光的细胞。植物原生质体的提取分离技术有大量报道，其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。

紫花苜蓿号称“牧草之王”，不仅适应性强、产草量高，而且营养丰富，还能形成根瘤进行固氮，是全世界栽培最悠久、面积最大、利用最广泛的豆科牧草。

现有技术公开了多种紫花苜蓿来源的原生质体的方法，如文献：《杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选》，《'陇东'紫花苜蓿原生质体最佳分离条件》，《紫花苜蓿原生质体游离条件的研究》，《扁蓿豆和清水野生紫花苜蓿原生质体分离与培养条件的筛选》，《苜蓿原生质体分离与培养的研究毕业论文》等，用酶解法分离清水紫花苜蓿(Medicagosativa L.cv.‘Qingshui’)愈伤组织来源的原生质体的方法，文中并公开了酶解时间、酶液组合、甘露醇浓度、预处理条件、继代时间及培养方法等。其中，一篇文章公开了最佳酶液组合和酶解时间分别为纤维素酶2％+果胶酶0.5％和8h；最佳离心转速和离心时间分别为500r/min和6min。

紫花苜蓿根部原生质体是一种非常有价值的实验材料，目前已经引起越来越多的人的兴趣，它不仅可以用于细胞生物学、遗传学、植物生理学甚至分子生物学的基础研究，同时也可以用于植物育种及作物改良方面。例如在分子生物学方面，我们可以研究其细胞壁的再生、质膜的功能与结构、细胞水平上植物抗逆性研究，因为原生质体能够引入外源遗传物质和在特定条件下具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力，所以它是遗传转化最为理想的材料。在转录组测序方面，由于10XGenomics单细胞技术的涌现，我们可以利用紫花苜蓿根细胞分析不同功能细胞异质性问题。但现有技术没有公开紫花苜蓿根部的原生质体提取方法，由于根部木质素丰富，所以提取原生质体难度大大增加。

现有技术中，用于根部原生质体提取的方法主要有机械提取法和酶解提取法，由于机械提取法过程复杂，且在实验过程中易对原生质体造成损伤，最终不仅提取的产量低，而且细胞碎片多。因此选用对原生质体伤害最小的酶解法是最佳的提取手段。

文献公开的提取方法是否适合紫花苜蓿根部原生质体的提取，不得而知。

本发明人采用现有技术提取蔷薇科根部原生质体文献中的方法提取的紫花苜蓿根部原生质体数量少，活性低，制备完成的悬浮液存在反转录抑制剂Ca²⁺和Mg²⁺，会严重影响后续实验的进行。如本发明人参考蔷薇科根部原生质体提取方法双酶解法，取1g根段进行实验，将提出的原生质体稀释4倍后，取0.1ml置于血球计数板中计算原生质体个数，最终提取的原生质体数量虽然达标平均数量为35.5X106，利用FDA溶液检测原生质体活性，所得活性很低，仅有71.5％左右，低活率的原生质体会影响后续实验的开展。