[发明专利]一种同时检测多种外源性和内源性甾体激素的方法

说明书

本发明提供了一种同时检测多种外源性和内源性甾体激素的方法，包括步骤：A、将待测样品进行前处理；B、将步骤A处理后的待测样品在SPE板上样；C、加入乙腈和水的混合溶液进行洗脱；D、再加入己烷洗脱，弃去洗脱液；E、加入甲醇和乙腈的混合溶液进行洗脱，收集洗脱液；F、将步骤E的洗脱液稀释后注入LC‑MS质谱仪进行检测分析，得多种外源性和内源性甾体激素的含量；外源性和内源性甾体激素的检测种类为54种或以上。本发明方法实现了在同一个样品中同时检测至少54个外源性和内源性甾体激素，可快速评价生物体的外源性激素暴露水平和内源性激素水平。该发明大大提高了体内甾体激素检测的速度、通量和覆盖的甾体激素的种类和数量。

技术领域

本发明涉及检测分析技术领域，具体涉及一种同时检测多种外源性和内源性甾体激素的方法，尤其涉及一种同时检测54种或以上的外源性和内源性甾体激素的方法。

背景技术

生物样品中甾体激素的测定，在公开发表的论文中有过报道，但是多为体内甾体激素，也称类固醇激素的测定，外源性甾体激素体内测定报道较少，也没有同时测定外源性和内源性共54个甾体激素的报道。

在之前的文献和公开专利中，有一些测定甾体激素的方法报道，但是因为甾体激素种类众多，结构类似，在分析上一直具有比较大的挑战。主要的挑战包括：甾体激素种类众多，从来源上可以分为内源性甾体激素和外源性甾体激素，内源性甾体激素来源于人体或者动物体的自身分泌，是身体功能正常运行的重要化学成分，作为激素的一种，在调节人体和动物体的生物功能上扮演着重要的作用；外源性甾体激素目前主要来源于药物(包括人药和兽药，大量的甾体激素在医药中被使用，特别是糖皮质激素，部分药物的不当使用会造成人体中外源性的甾体激素增加)、食品(主要来源于兽药的残留，兽药中的甾体激素会在动物源性的食品中残留，借食品的途径被人体摄入，包括动物肌肉、肝脏、肾脏、奶制品以及相关的其他肉奶制品；另外，保健食品中甾体激素的非法添加也会成为人体内甾体激素暴露的来源之一；)、环境(主要通过人类及动物的排泄，医院、制药厂废水的排放等途径进入环境，污水处理厂、畜牧场和水产养殖场是环境中类固醇激素的主要来源。目前的污水处理系统不能完全除去这些甾体激素，使得甾体激素和其代谢物在环境中蓄积，通过环境进一步被人体吸收入体内)、化妆品(糖皮质激素是皮肤科最常见的外用药物，可抑制纤维细胞再生，对皮肤具有一定的美白功效，但长期使用会产生激素依赖症及其他副作用，甚至引发癌症，对人体造成严重伤害。我国《化妆品卫生规范》2007版明确规定，糖皮质激素属于禁用物质。但是由于其具有明显的美白、祛痘等效果，不少厂家仍然非法向化妆品中添加糖皮质激素类物质)外源性甾体激素和内源性甾体激素列表见下表所示：

外源性甾体激素和内源性激素结构上有一定的类似性，外源性激素均为非体内自身分泌的激素，而是来源于人工合成的激素。外源性的激素因为其对人体的影响很大，目前也被称为内分泌干扰物质，这类化合物在低浓度下就可以干扰生物机体的内分泌系统正常功能，长时间暴露于低浓度内分泌干扰物质可能会导致一系列生殖和发育问题。目前已经发现男性精力数量出现下降，女性乳腺癌发病率上升，新生儿免疫力下降，这些现象都被证明和内分泌干扰物质有关。动物的调查显示，一些鸟类出现蛋壳变薄，孵化率下降，海豹免疫力下降，鱼类雌性化现象明显，雄鱼生殖腺退化。目前虽然甾体激素对于生物体健康状况的影响很大，但是对于这些甾体激素体内决定定量的报道非常有限，偶见报道也只是集中于少数外源性的甾体激素，没有涵盖市场上所有常见的外源性甾体激素。另外，也有报道仅测定体内内源性的甾体激素。体内甾体激素的含量常用于评价人体或者生物体的病理状态，例如21-羟化酶缺乏，11β-羟化酶缺乏，17-羟化酶缺乏，3-羟基类固醇脱氢酶缺乏，多囊卵巢综合征等等疾病。但是对于体内所有甾体激素的绝对定量，特别是对于外源性甾体激素的体内含量绝对定量，对于评价人体的健康状态至关重要。因为外源性甾体激素，对人体影响很大，长期暴露会造成很多的潜在的健康问题，这些化合物都是造成疾病的严重潜在风险，尽早检测尽早干预，对于人体的健康至关重要。