[发明专利]一种基于锰离子诱导的比率型荧光反应检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白活性的方法和应用

说明书

本发明涉及一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶和心肌钙蛋白。以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了发射强蓝色荧光、稳定性好的左多巴纳米颗粒，在Mn²⁺引发聚集后蓝色波长荧光降低，黄色波长荧光增强。利用Mn²⁺对P₃O₁₀^5‑的亲和力强于LFC表面的羟基，实现了比率型(F₅₅₀/F₄₆₀)荧光降低。但在ALP催化水解下，P₃O₁₀^5‑能迅速转化为磷酸根离子，从而实现比率型荧光增强检测ALP。我们以心肌钙蛋白为靶向抗原，ALP作为标记酶构建了一个比率型免疫荧光传感平台。该比率型传感平台在人血清中对ALP活性检测仍表现出快速的响应和良好的回收率。

技术领域

本发明涉及一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建及其分析应用，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP)和心肌钙蛋白，属于纳米生物传感技术领域。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是一种膜结合酶，广泛表达于肝、骨、肠、胎盘、肾脏等组织。它主要负责从各种蛋白质和非蛋白质底物中水解和转化磷酸单酯。作为公认的生物标志物，碱性磷酸酶在细胞周期生长、凋亡和信号转导途径等许多重要的生理和病理过程中发挥着重要作用。

此外，由于其具有高度的催化活性，广泛的底物特异性，容易与抗体结合，温和的反应条件和良好的稳定性等优点，ALP被广泛用作酶联免疫吸附测定(ELISA)中的标记酶，以产生可检测信号。因此，实现对ALP活性的高灵敏度和高选择性检测，对于ALP相关疾病的诊断和基于ALP的ELISA平台的开发具有重要意义。目前，有多种方法用于检测ALP，例如：比色法、化学发光法、电化学发光法及表面增强共振拉曼散射等方法。上述的方法存在一些不足：复杂的步骤，低灵敏度及长的响应时间。因此，实现对碱性磷酸酶的高选择性和高灵敏度检测将有利于临床相关疾病的诊断、监测与治疗。

为了克服这些不足，这里我们将采用温和的合成条件、简便的合成步骤构建了一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台，该检测方法兼具快速响应、高选择性和灵敏度高的优点。

发明内容

本发明解决的技术问题是：为了克服现有技术的不足，提出一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP)和心肌钙蛋白的方法。所述方法可以通过温和的合成条件、简单的合成步骤、便宜的合成原料制备出具有发射强蓝色荧光的纳米颗粒，通过比率型荧光值(F₅₅₀/F₄₆₀)与浓度的线性关系实现对碱性磷酸酶的高灵敏度检测。同时，又利用ALP在酶联免疫中作为标记酶的特性，构建了ALP引发的比率型荧光免疫传感器并应用于心肌钙蛋白I型的检测。

为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：一种基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测锰离子，以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的左多巴纳米颗粒LFC,Mn²⁺的加入导致LFC的快速聚集，导致468nm处的荧光强度随着Mn²⁺浓度的增加而减弱，而550nm处的荧光强度增强；将不同浓度的Mn²⁺分别加入到左多巴和乙二胺混合溶液中；震荡摇匀，通过荧光光谱仪进行荧光光谱测试，通过F₅₅₀/F₄₆₀荧光强度变化检测锰离子。

优选的，以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的LFC，在Mn²⁺引发聚集后造成了荧光发射波长的改变；将不同浓度的Mn²⁺分别加入400μL混合溶液中，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行荧光强度检测。