[发明专利]一种原位肝移植免疫耐受诱导方案的构建方法

权利要求书

1.一种原位肝移植免疫耐受诱导方案的构建方法，特征包括如下：

供体手术

(1)：选取在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下，饲养的体重为200～350g的SPF级大鼠Lewis)，手术前禁食12小时，但不禁水；

(2)：选取体重相差不大于40g大鼠作供体，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部剔毛，消毒；

(3)：将大鼠仰卧位固定于手术台，持续吸入异氟醚维持麻醉，横行切口打开大鼠腹腔，牵拉剑突暴露肝脏；

(4)：将肠管牵出腹腔左侧，并用湿纱布肠道，游离右肾静脉水平下的腹主动脉；

(5)：暴露腹腔干上的腹主动脉，用血管夹阻断它；

(6)：用细针头穿刺右肾静脉水平下的腹主动脉推注含低分子肝素625IU/Kg的生理盐水5ml，全身肝素化，逆行灌注肝脏；

(7)：在肠系膜上静脉剪一斜口，推注10ml乳酸林格氏液，再次灌注肝脏，剪开肾静脉水平下的下腔静脉放血至供体大鼠死亡，停止麻醉，多次向肝脏浇注0-4℃的生理盐水，防止肝脏复温：

(8)：结扎肠系膜上静脉分支和脾静脉，游离出肠系膜上静脉。游离腹腔干，结扎脾动脉，胃左动脉。保留肝外胆管5mm处，插入支撑管入胆道，一并结扎幽门静脉和胃十二指肠动脉。游离并结扎左、右肾上腺静脉，用10-0丝线结扎右肾静脉，在左肾静脉水平切断下腔静脉；

(9)逆时针分离肝脏周围组织，紧贴肝脏结扎左膈下静脉，紧贴膈肌切断肝静脉，移出供肝，置入0-4℃的乳酸林格氏液；在后台上，在门静脉和下腔静脉分别套上袖套管，如半肝(50％)移植物，结扎并剪除肝左叶，尾状叶，中叶的左半部分。如70％移植物，结扎并剪除肝左叶；

受体手术

(1)选取在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下，饲养的体重为200～350g的SPF级大鼠(BN，Lewis)，手术前禁食12小时，但不禁水；

(2)选取体重相差不大于30g大鼠作受体，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部剔毛，消毒；

(3)将大鼠仰卧位固定于手术台，持续吸入异氟醚维持麻醉，中间纵向切口打开大鼠腹腔，牵拉剑突暴露肝脏；左右肋弓用回形针自制拉钩牵拉；

(4)自肝胃韧带逆时针分离切断肝周组织，近膈肌结扎左膈下静脉，结扎左右肾上腺静脉，骨骼化下腔静脉至右肾静脉水平，结扎肝固有动脉，在胆总管近端切断，用蚊式钳钳夹膈肌环，血管夹分别阻断门静脉，下腔静脉，近肝切断肝上下腔静脉，肝下下腔静脉，门静脉，移出受体原肝；停止吸入异氟醚；

(5)原位放置供肝，一点法，自左向右用8-0血管线缝合肝上下腔静脉后壁，前壁，移去蚊式钳，换用哈巴狗血管夹阻断肝上下腔静脉。袖套管法连接门静脉后，移去门静脉血管夹，肝上下腔静脉哈巴狗血管夹以恢复门静脉血流。袖套管法连接肝下下腔静脉，恢复血流，经阴茎背静脉注射10ml生理盐水，帮助恢复血循环。在门静脉右侧，血管夹阻断肝总动脉，结扎胃十二指肠动脉，在肝总动脉用剪刀剪出斜口，将供肝动脉的支撑管插入肝总动脉，结扎固定后开放，恢复肝动脉血流，同法，连接胆道；

(6)用4-0线连续缝合正中切口后，涂上利多卡因胶浆减轻疼痛，间断缝合皮肤层。术中给予环孢素(CSA)4mg/kg皮下注射，腹腔注射头孢唑100mg/kg；

(7)麻醉清醒后予以红外线灯非直接照射大鼠保暖12小时，在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下继续饲养，观察大鼠的生存情况；

(8)术后实验组皮下注射粒细胞集落刺激因子100u/kg，一天一次，共5次；皮下注射头孢唑肟钠100mg/kg，一天一次，共3次；环孢素4mg/kg，一天一次，共9次。对照组皮下注射头孢唑肟钠100mg/kg，一天一次，共3次；环孢素4mg/kg，一天一次，共9次。

2.根据权利要求1所述的一种肝移植免疫耐受的动物模型的构建方法，其特征是所获得的大鼠受体获得耐受，耐受率达100％，时间10月以上。

3.本发明可延伸到其他大鼠供-受体不同组合的耐受诱导的基础研究，以及可能采用的所有实验大动物如猪、狗、羊、马，猴以及人类等。