[发明专利]一种原位肝移植免疫耐受诱导方案的构建方法

说明书

本发明公开一种原位肝移植免疫耐受方案及其动物模型的构建方法。其所述动物模型设计巧妙、合理、重复性好，符合大鼠原位肝移植术要求，和人肝移植相似。术后存活率高，重复性好，耐受率高达100％，在术后经肝功能检测，病理分析证实。能有效解决研究目标和肝移植完整复制过程所涉及时间久、死亡率高、人员和显微技术要求高等问题。同时可延伸到其他供‑受体不同组合的耐受诱导的基础研究。

技术领域

本发明涉及动物模型构建技术及其耐受诱导方案，具体是指原位肝移植术的动物模型的构建方法和免疫耐受诱导方案确定。

背景技术

肝移植是公认的治疗终末期肝病的唯一有效手段，但大数据研究结果报道肝移植受者长期生存几乎未有进展。病人未有更好长期生存(2年或以上生存率)收益。主要原因就是长期使用免疫抑制剂，免疫抑制剂的终生使用带来一系列并发症：肾功能不全发生于25％的受者；神经毒10％and 30％的受者；糖尿病9-18％；20-33％肾、26-40％肝、29％肺受者发生心血管疾病；移植的第4位死亡原因为感染，发生于2/3的受者；新生肿瘤11倍于常人，消化系疾病：12％受者，高脂血症：46％受者，血液系疾病：30％受者；发育、生活质量欠满意，经济耗费巨大：若一个肝移植受者生存15年，每年则花费6-7万，总计100万以上。耐受方案实施应用于人类，不仅可以大大减少前述相关并发症，还可以免除巨额费用100万元/人，中国每年肝移植例数为5000人次，每年节省费用总计50亿元。全世界肝移植每年约20000人，则总计约200亿，一肝二受，理论上移植受者增加一倍，则为400亿。

免疫(移植)耐受是指在完全停用免疫抑制剂情况下，移植物功能良好，无病理证实的慢性排斥反应(Banff标准)。对人类器官移植，该状态保持至少1年。对大鼠，4-6月即可。诱导器官移植耐受，被称为该领域的另一个圣杯。方法归纳为：1)T细胞的清除；2)共刺激通路的阻断；3)混合嵌合体的诱导；4)提高调节性T细胞。上述方案针对受体免疫系统进行干预，副作用极大。目前方案集中于供者特异性免疫无反应和持续的混和嵌合体维持。

目前通用的耐受模型采用全肝移植物，但世界范围都没有临床应用的方案。

因此，一种用于研究肝移植免疫耐受的方案，亟待研究解决。

发明内容

寻找用于研究和可能临床应用的免疫耐受方案是器官移植领域的最重要目标。为解决这个问题，我们从供体移植物着手，发明构建免疫耐受的新模型、新方案。其构建方法，包括以下步骤：

供体手术

(1)：选取在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下，饲养的体重为200～350g的SPF级大鼠(SD，Lewis)，手术前禁食12小时，但不禁水；

(2)：选取体重相差不大于30g大鼠作供体，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部剔毛，消毒；

(3)：将大鼠仰卧位固定于手术台，持续吸入异氟醚维持麻醉，横行切口打开大鼠腹腔，牵拉剑突暴露肝脏；

(4)：将肠管牵出腹腔左侧，并用湿纱布包裹肠道，游离右肾静脉水平下的腹主动脉；

(5)：暴露腹腔干上的腹主动脉，用血管夹阻断它；

(6)：用1号针头穿刺右肾静脉水平下的腹主动脉推注含低分子肝素625IU/Kg的生理盐水5ml，全身肝素化，逆行灌注肝脏；

(7)：在肠系膜上静脉剪一斜口，推注10ml乳酸林格氏液，再次灌注肝脏，剪开肾静脉水平下的下腔静脉放血至供体大鼠死亡，停止麻醉，多次向肝脏浇注0-40℃的生理盐水，防止肝脏复温；

(8)：结扎肠系膜上静脉分支和脾静脉，游离出肠系膜上静脉。游离腹腔干，结扎脾动脉，胃左动脉。保留肝外胆管5mm处，插入支撑管入胆道并固定。一并结扎幽门静脉和胃十二指肠动脉。游离并结扎左、右肾上腺静脉，用10-0丝线结扎右肾静脉，在左肾静脉水平切断下腔静脉；