[发明专利]基于MRM的植物组蛋白变体H3.3的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种基于MRM的植物组蛋白变体H3.3的定量检测方法，属于化学检测技术领域。所述定量检测方法包括：鉴定组蛋白变体H3.3K27‑R40不同形式修饰的肽段，并合成组蛋白变体H3.3K27‑R40不同形式修饰的标准肽段，利用质谱多反应监测技术对所述标准肽段进行质谱定量条件优化，以实现对组蛋白变体H3.3K27‑R40不同形式修饰的肽段的定量检测。该方法实现了基于MRM对植物体内的组蛋白H3.3及其修饰肽段快速、准确和高通量的定量检测。

技术领域

本发明涉及化学检测领域，特别是涉及一种基于MRM的植物组蛋白变体H3.3的定量检测方法。

背景技术

组蛋白作为染色质的组成部分，其翻译后修饰对染色质的结构和功能起到重要的调控作用。通常认为真核生物染色质的基本单元是核小体，核小体由含147个碱基对的DNA缠绕组蛋白八聚体(由四种组蛋白H2A、H2B、H3和H4组装而成)构成，核小体之间通过组蛋白H1连接逐步形成其高级结构。除了常规的四种组蛋白外，还包括许多组蛋白的变体，组蛋白不同变体可能携带完全不同的生物学信息，例如组蛋白H3.3主要与转录激活相关。组蛋白变体和其修饰也共同参与染色质的表观遗传。现有报道发现H3氨基尾端(1-40aa)几乎所有的赖氨酸和精氨酸上均可发生翻译后修饰，特别是甲基化和乙酰化修饰。关于组蛋白H3.3的功能以及对植物生长发育的影响研究越来越受到重视。H3.3在愈伤组织形成过程中涉及到细胞命运的转变以及表观遗传重编程。H3.3甲基化修饰对愈伤组织形成，进而对植物的生长发育具有重要调控功能。可见，精准、高效的定量组蛋白变体H3.3上的翻译后修饰对理解组蛋白变体信号在植物愈伤组织形成的机制和植物育种中具有重要的意义。

质谱已经成为一项关键的组蛋白分析技术，然而组蛋白变体H3.3上翻译后修饰的分析难点在于组蛋白翻译后修饰状态多样化，各个不同变体间存在相互干扰，同时组蛋白上修饰状态和修饰位点的精准定位需要高质量的串级谱图信息。例如仅H3上K27-R40这一肽段上存在两个重要的修饰位点K27和K36，对应20种不同组合形式的修饰(K27上有5种，K36上有4种)，在常规数据依赖的质谱采集模式下，许多低丰度修饰肽段因为离子强度不够而被过滤掉，其次，不同变体，不同修饰的肽段常常出现共流出以及混合谱的问题，导致修饰的定位和定量准确度大大降低。目前还没有一种能够针对植物组蛋白变体的翻译后修饰进行准确的定量检测方法，基于现有技术手段的现状，本申请的发明人拟提供一种高通量，高灵敏度，以及高可信度的组蛋白变体H3.3的MRM定量方法，本方法能解决植物组蛋白变体H3.3上翻译后修饰的精准定量问题，并可应用于植物学、表观遗传学等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于MRM的植物组蛋白变体H3.3的定量检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，基于MRM可以对植物体内的组蛋白H3.3及其修饰肽段快速、准确和高通量的进行定量检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种基于MRM的植物组蛋白变体H3.3的定量检测方法，鉴定组蛋白变体H3.3 K27-R40不同形式修饰的肽段，并合成组蛋白变体H3.3 K27-R40不同形式修饰的标准肽段，利用质谱多反应监测技术对所述标准肽段进行质谱定量条件优化，以实现对组蛋白变体H3.3 K27-R40不同形式修饰的肽段的定量检测。

优选的是，具体包括以下步骤：

步骤1：提取植物体内组蛋白，通过组蛋白胶内衍生化反应及酶解，获取组蛋白H3的不同变体；

步骤2：利用HPLC/MS/MS鉴定组蛋白H3变体H3.3 K27-R40不同形式修饰的肽段，并挑选出可用于质谱多反应监测分析用的肽段样品；

步骤3：合成组蛋白变体H3.3 K27-R40不同形式修饰的标准肽段，筛选特异的母子离子对；

步骤4：利用质谱多反应监测技术对所述标准肽段进行质谱优化，然后利用优化条件定量检测植物样本中组蛋白变体H3.3 K27-R40不同形式修饰的肽段含量。