[发明专利]一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用

说明书

本发明细胞培养技术领域，具体涉及一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用。本发明采用脐带间充质干细胞上清液和/或银胶菊内酯培养原代细胞，相较于传统组织块贴壁法，能有效缩短原代脐带间充质干细胞的制备时间，且保持其较好的细胞活率、表型及功能。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，它有自我更新和多项分化的潜能，具有低免疫原性，增殖能力强等特点，广泛存在于骨髓、脂肪、脐带、胎盘、牙齿、滑膜等组织中。其中脐带间充质干细胞(Umbilicalcord Mesenchymal Stem Cells，UCMSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞，与其他组织来源的间充质干细胞相比，具有来源丰富、取材方便，无伦理学争议，低免疫原性等优点。

脐带间充质干细胞在体内或体外的特定诱导条件下有分化成脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的能力。因其具有多向分化的潜能，所以在临床中可广泛应用到神经系统疾病、心血管系统疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病、糖尿病、肌肉变性病、肝脏疾病及慢性疼痛等疾病的治疗中，具有十分广阔的应用前景。脐带间充质干细胞还可以分泌外泌体，外泌体中含有多种分子成分，包括蛋白质、脂质、信使核糖核酸(Messenger RNA，mRNA)以及微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)，具有执行免疫调节、促进细胞再生以及促血管新生等功能。

干细胞的产业化发展，包括上游的干细胞库、中游的干细胞扩增技术和质检技术，以及下游的干细胞产品。国内外许多机构都在开展间充质干细胞的储存工作，而短时间高效的从脐带中分离出干细胞的方法变得极其重要。目前，国内外制备原代间充质干细胞应用最广泛的方法是组织块贴壁法。而随着时间的发展传统的组织块贴壁方法已经跟不上干细胞研究的步伐，组织块贴壁法培养时间较长，分离效率低，且长时间的培养增加了各种菌污染的机率。所以对传统组织块贴壁法进行改良，缩短原代培养的时间以满足临床和科研的需求变得至关重要。

在原代干细胞制备方法中，某些专利通过优化培养基以改进传统的组织块贴壁法，如专利CN201480030461.1，CN201910155437.5，CN201910334392.8等，通过配制自有的培养基在原代制备和传代过程中使用，虽然也提高了分离培养周期，但是自有化的培养基没有商品化的培养基稳定。还有一些专利和文献在原代培养过程中将组织块回收利用再次贴壁，如专利CN201711365354.6和《关于改良差速贴壁法原代培养大型成年哺乳动物绵羊肌源性干细胞的研究》(李玢等，中国计划生育和妇产科，2017年，第9卷第12期，第25-29页)。

因此，亟需提供一种明显缩短脐带间充质干细胞原代培养时间，细胞活率高的培养基及培养方法。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种原代脐带间充质干细胞的培养基及其应用。采用本发明所述的培养基，相较于传统组织块贴壁法，培养时间明显缩短，且在表型、细胞活率、成脂成骨诱导能力和增殖生长曲线上无明显差异。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种脐带间充质干细胞上清液的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)收集脐带间充质干细胞培养液，加入柠檬酸脂肪酸甘油酯，所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.01-0.1％，混匀；

(2)向步骤(1)得到的混合物中加入银胶菊内酯，所述的银胶菊内酯的浓度为50-200μg/mL，混匀；

(3)将步骤(2)的混合物离心，取上清。

具体地，步骤(1)中所述的柠檬酸脂肪酸甘油酯的含量为0.01-0.05％，优选为0.03％。