[发明专利]一种SAC-TRAIL融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种SAC-TRAIL融合蛋白，其特征在于，抗肿瘤蛋白TRAIL通过柔性链接(G₄S)₃融合到SAC蛋白的C末端，形成所述的SAC-TRAIL融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种SAC-TRAIL融合蛋白，其特征在于，所述的SAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的抗肿瘤蛋白TRAIL的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求1所述的一种SAC-TRAIL融合蛋白，其特征在于，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.一种如权利要求1～3任一所述的SAC-TRAIL融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)构建pET28a/SUMO-SAC-TRAIL重组质粒；

(2)利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达SUMO-SAC-TRAIL融合蛋白；

(3)利用镍离子亲和层析和弱阳离子交换树脂分离纯化SAC-TRAIL融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的一种SAC-TRAIL融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，构建pET28a/SUMO-SAC-TRAIL重组质粒包括以下步骤：

(1-1)以序列如SEQ ID NO:5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO:6所示的下游引物为反应引物，以全长的SUMO-SAC基因为模板，其中SUMO-SAC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，

以序列如SEQ ID NO:8所示的上游引物和序列如SEQ ID NO:9所示的下游引物为反应引物，以全长的TRAIL基因为模板，其中TRAIL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，

PCR反应，获得SUMO-SAC和TRAIL蛋白的编码基因；

(1-2)胶回收步骤(1)的PCR产物，以序列如SEQ ID NO:5所示的上游引物和序列如SEQID NO:9所示的下游引物为反应引物，以全长的SUMO-SAC和TRAIL基因为模板，融合PCR反应，获得SUMO-SAC-TRAIL融合蛋白的编码基因，即目的基因；

(1-3)胶回收步骤(2)的PCR产物，将目的基因和pET28a表达质粒用BmtⅠ和XhoⅠ进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pET28a/SUMO-SAC-TRAIL重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆送样测序。

6.根据权利要求5所述的一种SAC-TRAIL融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR反应的条件是：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s，循环30次，最后72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述的一种SAC-TRAIL融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达SUMO-SAC-TRAIL融合蛋白包括以下步骤：将测序正确的含有pET28a/SUMO-SAC-TRAIL重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含50mg/L卡那霉素抗性的LB培养基中37℃培养，当OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，18℃诱导16h，异源表达SUMO-SAC-TRAIL融合蛋白。