[发明专利]一种SAC-TRAIL融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种SAC‑TRAIL融合蛋白及其制备方法和应用，利用柔性链接(G₄S)₃将抗肿瘤蛋白TRAIL融合到SAC蛋白的C末端，形成所述的SAC‑TRAIL融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；该融合蛋白的制备方法包括以下步骤：(1)构建pET28a/SUMO‑SAC‑TRAIL重组质粒；(2)利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达SUMO‑SAC‑TRAIL融合蛋白；(3)利用镍离子亲和层析和弱阳离子交换树脂高效分离纯化SAC‑TRAIL融合蛋白。与现有技术相比，本发明首次制备了SAC‑TRAIL融合蛋白，纯化蛋白的纯度达到94％，制备的蛋白药物SAC‑TRAIL能够有效抑制卵巢癌细胞SK‑OV‑3和乳腺癌细胞MCF‑7的增殖，IC₅₀值分别为4.42ng/mL和0.053μg/mL。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种SAC-TRAIL融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

在妇科肿瘤中，卵巢癌和乳腺癌为常见的恶性肿瘤，发病率越来越高。目前对癌症的治疗主要依靠化疗、放疗、免疫治疗和靶向治疗，但大多数治疗策略不能完全清除癌细胞。在恶性肿瘤中，TRAIL对癌细胞具有广泛的凋亡诱导作用，且几乎不抑制正常细胞的增殖，被鉴定为一种抗肿瘤蛋白。TRAIL能与癌细胞表面的死亡受体4/5(DR4/5)结合，同时激活一系列的凋亡信号通路，促进癌细胞的凋亡。TRAIL在癌症治疗中表现出良好的应用前景，但TRAIL与非死亡受体(如DcR1)结合后，可以激活如NF-κB激酶信号通路来刺激促进细胞存活、增殖和迁移的通路，这也是肿瘤细胞对TRAIL产生耐药性的原因之一。临床数据也显示TRAIL对具有高NF-κB活性的肿瘤细胞没有明显的增殖抑制作用，进而使肿瘤细胞对TRAIL的治疗表现出耐药性。Par-4作为一种肿瘤抑制因子，最初是在凋亡的前列腺癌细胞中发现，并在各种细胞中广泛表达。通过对Par-4的序列进行缺失性分析，确定其核心结构域为SAC，它包含59个氨基酸。核心结构域SAC可以进入细胞核，激活caspase，抑制NF-κB激酶信号通路，并选择性地诱导癌细胞凋亡，而对正常细胞或组织几乎没有细胞毒性，被证明是一种有希望的癌症治疗候选物。

SAC能够有效的抑制NF-κB的活性，SAC重组蛋白有发展为抗肿瘤药物的潜力。迄今为止，SAC的研究还集中在探究其作用机制这部分，关于运用基因工程技术制备SAC融合蛋白，并将其用于克服肿瘤细胞对TRAIL耐药性的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高纯度的SAC-TRAIL融合蛋白及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面提供一种SAC-TRAIL融合蛋白，抗肿瘤蛋白TRAIL通过柔性链接(G₄S)₃融合到SAC蛋白的C末端，形成所述的SAC-TRAIL融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述的SAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的抗肿瘤蛋白TRAIL的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明第二方面提供一种所述的SAC-TRAIL融合蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)构建pET28a/SUMO-SAC-TRAIL重组质粒；

(2)利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达SUMO-SAC-TRAIL融合蛋白；

(3)利用镍离子亲和层析和阳离子交换树脂高效分离纯化SAC-TRAIL融合蛋白。

优选地，步骤(1)中，构建pET28a/SUMO-SAC-TRAIL重组质粒包括以下步骤：