[发明专利]一种提高CE酶结构异构催化活性的方法及其突变体

说明书

本发明公开了本发明涉及一种提高CE酶结构异构催化活性的方法及其突变体，属于酶工程领域。本发明以来源于Caldicellulosiruptorsaccharolyticus的纤维二糖差向异构酶(CsCE)为研究对象，基于序列比对及晶体结构分析的半理性策略，对底物结合相关的位点进行点饱和突变，获得了多个结构异构催化活性显著提高的突变体，其结构异构活性较野生型CE酶提高了约36～232％。发明为CE酶改良提供了可行性方案，对于促进乳果糖的酶法工业化合成具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种提高CE酶结构异构催化活性的方法及其突变体，属于酶工程领域。

背景技术

乳果糖(Lactulose，β-D-半乳糖基-1,4-D-果糖)是一种非消化性二糖，因其具有促进双歧杆菌的生长、 调节肠道pH值、抑制病原菌的生长等益生元特性而被广泛应用于食品和药品行业。目前，市场上的商业 化乳果糖主要通过化学法生产，生产过程中会产生高水平的副产物，并且化学法涉及复杂的分离和纯化步 骤易造成严重的环境污染，这些缺陷制约了乳果糖的应用。酶法合成乳果糖由于催化条件温和且生产更为 安全成为当前生产乳果糖的研究热点。当前用于酶法生产乳果糖的酶主要为β-半乳糖苷酶和纤维二糖差向异构酶(CE)。其中，β-半乳糖苷酶生产过程中需要加入共底物果糖，存在副产物较多和乳果糖转化率较 低(约15％)的缺点。

当前报道的CE酶主要具有差向异构活性，而一些来源于嗜热微生物的CE酶，如Caldicellulosiruptor saccharolyticus(CsCE)，Dictyoglomus turgidum(DtCE)，Spirochaeta thermophila(StCE)，Caldicellulosiruptor obsidiansis(CoCE)和Dictyoglomus thermophilum(DhCE)具有结构异构催化活性，即可以催化乳糖底物生成 乳果糖，成为新型生产乳果糖的方法。与传统的β-半乳糖苷酶法生产乳果糖相比，CE酶具有更高的生产效 率且不需要共底物的参加，这为乳果糖的生产提供了更好的选择。

然而，利用CE酶制备乳果糖的方法仍存在着底物亲和力差、结构异构活性较低(大多数情况下不超 过差向异构化活性的10％)且有副产物依匹乳糖生成等缺陷，制约了其工业化应用进程。迄今为止，CsCE 的改造取得诸多成果，如通过随机突变方法提高了其结构异构活性；通过定点突变的方法提高了CE酶的 热稳定性等，但是其底物亲和力、乳果糖转化率及热稳定性等催化特性并未得到较大改善。

发明内容

[技术问题]

现有技术中CE酶的底物亲和力、乳果糖转化率和热稳定性未得到较大的改善，无法应用到乳果糖工 业化生产。

[技术方案]

本发明提供一种提高CE酶催化性能的分子改造方法，即基于半理性设计，通过点饱和突变技术重塑 CE底物结合口袋，获得具有高底物亲和力、结构异构活性的CE酶。本发明构建的突变体具有良好的催化 特性，对于促进乳果糖的绿色、高效合成具有重要意义。

本发明的第一个目的是提供一种纤维二糖差向异构酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生酶的基础上，将第371位和/或第355位进行突变。

在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生酶的基础上，将第371位 谷氨酰胺突变为丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或精氨酸，将355位的色氨酸突变为丙氨 酸或谷氨酰胺。

在一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.9所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述纤维二糖差向异构酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供表达所述纤维二糖差向异构酶突变体或含有上述基因的载体。