[发明专利]一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：（1）在无菌条件下取离体的脂肪组织用生理盐水冲洗干净，剪成碎块后待用；（2）向步骤（1）的脂肪组织碎块中加入消化液消化处理；（3）向步骤（2）消化后的脂肪组织中加入添加丙戊酸钠、铁(II)酞菁的培养基重悬，培养1‑2天后更换培养基，培养基中添加以下成分：去甲斑蝥素、桑根酮C、N‑烟酰甘氨酸，培养至细胞融合度达到80%‑90%，消化后即得用于传代培养的脂肪间充质干细胞。本发明提供一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法，经连续培养细胞的融合度在段时间内可达到80‑90%，细胞在原代培养过程中的增殖活性得到改善，为脂肪间充质干细胞的临床应用提供充分的保障。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一群具有多能性的细胞，可从包括脂肪、骨髓、脐带织在内的各种组织中分离得到。因为它们具有可塑性，这些细胞具有巨大的临床和基础研究的吸引力。

脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，能够在一定的诱导因子作用下，分化成软骨、成骨、脂肪、神经组织及其他组织或器官。脂肪间充质干细胞作为重要的种子细胞之一，是目前临床研究广泛使用的间充质干细胞，，其应用价值主要表现在组织修复与重建，适用于修复各种缺乏再生能力的组织，如软骨、肌肉、心肌、神经等，脂肪间充质干细胞来源充足，可通过较简单的方法大量提取，具有广阔的研究和应用前景。

脂肪间充质干细胞体外分离培养过程关系到干细胞临床应用的安全性。体外培养过程包括分离培养和传代培养，其中分离培养将脂肪组织经处理后得到用于传代培养的脂肪间充质干细胞的过程，因此，分离培养过程将影响用于传代培养的细胞的质量，现有的脂肪间充质干细胞分离培养过程存在以下问题：培养过程中使用添加胎牛血清的培养基，胎牛血清的成本较高，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，会对干细胞的临床使用的安全性产生潜在风险，不能满足临床的需求。因此有必要提供一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法，提高脂肪间充质干细胞体外增殖的效率。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法，不添加胎牛血清，培养得到的原代脂肪间充质干细胞活性好，数量多，为细胞的传代培养提供条件。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

（1）在无菌条件下取离体的脂肪组织用生理盐水冲洗干净，剪成碎块后待用；

（2）向步骤（1）的脂肪组织碎块中加入消化液消化处理，消化终止后，加入D-hanks溶液稀释，离心后去除上清；

（3）向步骤（2）离心后的沉淀中加入添加丙戊酸钠、铁(II)酞菁的培养基重悬，接种在培养皿中于37℃，5%CO₂的培养箱中培养1-2天后更换培养基，培养基中添加以下成分：去甲斑蝥素、桑根酮C、N-烟酰甘氨酸，此后每2-3天更换一次添加上述成分的培养基，培养至细胞融合度达到80%-90% ，消化后即得用于传代培养的脂肪间充质干细胞。

进一步地，所述步骤（3）中培养基为DMEM/F12培养基。

进一步地，所述丙戊酸钠、铁(II)酞菁在培养基中浓度为：丙戊酸钠8-13ng/mL、铁(II)酞菁1-4.5 ng/mL。

进一步地，所述丙戊酸钠、铁(II)酞菁在培养基中浓度为：丙戊酸钠10ng/mL、铁(II)酞菁3 ng/mL。

进一步地，所述去甲斑蝥素、桑根酮C、N-烟酰甘氨酸在培养基中的浓度为：去甲斑蝥素1-5ng/mL、桑根酮C10-20μg/mL、N-烟酰甘氨酸15-25μg/mL。