[发明专利]一种抗传染性脾肾坏死病毒的载体疫苗的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种抗传染性脾肾坏死病毒的载体疫苗的构建方法及应用，属于病毒基因工程技术领域。所述载体疫苗包括利用家蚕核型多角体病毒表达的如SEQ IDNO：10所示抗原蛋白MCP，所述抗原蛋白是由如SEQ ID NO：1所示的cmv‑mcp表达盒编码。本发明通过将巨细胞病毒启动子cmv控制的mcp表达盒cmv‑mcp克隆到转移质粒构建重组质粒，再转化感受态细胞后获Bacmid‑MCP，Bacmid‑MCP DNA转染家蚕培养细胞获BmNPV‑MCP，再将其接种家蚕4‑5龄幼虫或初化蛹，发病后匀浆，即得载体疫苗。该疫苗通过注射、口服或浸泡的方法对鳜/鲈进行免疫，可减少传染性脾肾坏死病的发生。

技术领域

本发明涉及病毒基因工程技术领域，特别是涉及一种抗传染性脾肾坏死病毒的载体疫苗的构建方法及应用。

背景技术

传染性脾肾坏死病毒(Infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)属于肿大细胞病毒属的成员，能感染鳜(Siniperca chuatsi)、大口黑鲈(Micropterussalmoides)，致死率高，严重的危害鳜和大口黑鲈养殖业的发展。免疫技术在鱼类病害防治中日益成为一种安全、有效、环保的新型防控技术。中国已成功研制的水产疫苗超过50种，涉及近30种病原体。目前，常见的疫苗主要有：灭活疫苗(死疫苗)、减毒疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗以及mRNA疫苗等。不同类型的疫苗各有优缺点。

灭活疫苗制备相对较容易，但由于灭活疫苗不具备感染活性，只能刺激机体体液免疫，免疫持续时间短，故存在免疫效果不理想和免疫力持久性差等问题。

减毒活疫苗是通过物理、化学方法使病原体毒力减弱，且留有其免疫原性。将其接种到免疫对象体内时，病原体可生长，诱导机体免疫反应，且不伤害免疫对象，但生产成本高，有恢复致病性的潜在危险，安全性较差。

亚单位疫苗是一种利用微生物(抗原)的某种表面结构成分，诱导机体产生抗体的疫苗，具有抗原性强、保护时间长、安全性好、制备和运输方便等优点，但疫苗制备需复杂的纯化技术和工艺，制作成本高，且抗原表位易丢失，病毒往往通过突变逃避免疫。

合成肽疫苗，是根据天然蛋白质的氨基酸序列，人工合成保护性短肽,并与载体连接后加佐剂的安全新型疫苗。该类疫苗可使机体产生免疫力，引起免疫应答的性能不足，T细胞和B细胞抗原表位之间协同作用困难。

重组载体疫苗是运用基因工程技术将病原的抗原基因整合到其它非致病性病原或细菌内，并能使免疫对象体内表达抗原基因。重组载体疫苗免疫效果好，且易于控制，但受载体表达水平影响较大，同时可能对环境安全造成影响。

DNA疫苗是将抗原的基因插入到表达载体上，然后导入到体内表达抗原蛋白，诱导机体产生抗体，以达到防治疾病的目的。DNA疫苗制备相对较方便，可以按要求将不同的抗原表位组合制备联合疫苗，DNA疫苗是新一代疫苗的研发方向，但DNA疫苗有整合到基因组风险，且如何高效将DNA疫苗交付至细胞内仍面临挑战。

mRNA疫苗是指通过脂质体纳米颗粒包裹将mRNA转染进细胞内表达抗原蛋白。mRNA疫苗设计方便，易于生产，既可以产生体液免疫，又可以产生细胞免疫，免疫保护率高，在应对新的突发性传染性疾病方面具有明显的优势。mRNA疫苗自身不稳定，很容易降解；人工合成原料以及包裹mRNA的脂质纳米颗粒可产生毒性；储藏运输的条件较为严苛，需要冷链运输。

鱼的免疫接种方式对免疫效果和推广应用有重要的影响。水产疫苗的常见免疫方式包括注射免疫、浸泡免疫和口服免疫。注射免疫是最常见的免疫方法，可保证抗原数量，刺激鱼体产生长时间的免疫保护，但容易对鱼造成损伤，费时费力，且不适用于较小的鱼。口服免疫是将抗原包被后与饲料混合喂食，可避免鱼应激反应，可大量对鱼进行免疫、损伤小、方法简便、易操作，但因疫苗在消化道中易破坏降解而导致免疫保护效果较差；浸泡免疫对鱼不易造成损伤，且对免疫鱼的大小没有要求，是最方便的免疫接种方式，但需要的疫苗量大，免疫效果相对较差。因此，有必要寻找新的疫苗载体系统。