[发明专利]一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法

权利要求书

1.一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：准备试剂；

步骤二：制备Incubation Mix，在4℃下操作；

步骤三：抗体Antibody稀释1：15，抗体放置在-80℃，0.5ul抗体+7.5ulH2O(过量)，抗体用完后及时放回-80℃；

步骤四：Antibody Mix制备，过量，2个样品一般制备3个的量；

步骤五：Incubation Mix+Antibody Mix混合，4℃转速40旋转孵育过夜，17h；

步骤六：Ipure Kit v2试剂准备；

步骤七：DNA洗涤，洗涤过程中，磁力架和wash buffer要及时放回冰上；

步骤八：Ipure kit V2试剂盒洗脱并纯化DNA，转速均用40rpm；

步骤九：XP磁珠纯化。

2.根据权利要求1所述的一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，试剂准备过程包括：

S1：配置1*MagbufferA，选择5*MagbufferA和H20按1:4稀释，一个文库需要的buffer量(过量的)，多个文库时依次倍增；

S2：准备磁珠，室温操作，每个样品取11ul磁珠，用22ul的1*MagbufferA洗涤两次后，再用22ul的1*MagbufferA将其重悬，样品增加时，磁珠量依次倍增。

3.根据权利要求1所述的一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，选择5*MagbufferA、MagbufferB、Filler DNA(-20℃)、Library DNA和H₂O漩涡或吹打混匀，置于预热至95℃的PCR仪中，立即置于冰浴10min。

4.根据权利要求1所述的一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法，其特征在于，所述步骤四中，Antibody Mix制备，选择15Ab、5*MagbufferA和MagbufferC(-20℃)。

5.根据权利要求1所述的一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法，其特征在于，所述步骤五中，选择5ul的Ab Mix、75ul的Incubation Mix和20ul的磁珠混合，将剩余的IncubationMix作为Input置于4℃过夜。

6.根据权利要求1所述的一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法，其特征在于，所述步骤六中，Ipure Kit v2试剂准备包括：

BufferA(4℃恢复室温(水浴锅30℃-40℃放置一会)，拿出后用酒精擦拭)；

BufferB：室温放置；

每个样品包括一个Input和1个MeDIP，各需100ulElution buffer，按上表的量配置，制备完成后轻颠倒混匀，瞬离放室温；磁力架放置在冰上预冷，Carrier RNA从-20℃放置于冰上溶解；用酒精擦拭漩涡震荡仪备用。

7.根据权利要求1所述的一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法，其特征在于，所述步骤七中，DNA的洗涤过程为：

(1)取出孵育过夜的Mix，瞬甩，置于预冷的磁力架上，2min后，吸掉上清；

(2)MeDIP试剂盒中WashBuffer-I洗3次。加入Magwash buffer-I 100ul，吹打混匀，4℃旋转混匀5min，置于磁力架上2min，弃上清，重复3次；

(3)用150ul的WashBuffer-2洗一次，吹打混匀，4℃旋转混匀5min，置于磁力架上2min，弃上清。

8.根据权利要求1所述的一种捕获cfDNA5mC片段的检测方法，其特征在于，所述步骤九中，XP磁珠纯化包括：

(1)加40μl重新悬浮过的XP珠子和每个样品混合，及时用枪尖吹打20次；

(2)室温孵育5分钟；

(3)将珠子放在磁石座上，放置于磁力架时不要将管子放的太低，待液体完全澄清之后，用量程大于溶液总体积的大小枪尖组合吸走上清液；

(4)加200μl的80％乙醇到每个管中，等待30秒后，用量程大于溶液总体积的大小枪尖组合吸走上清液；

(5)重复第13步，用乙醇共洗两次，吸出多余的乙醇；

(6)在磁性支架上孵育5分钟或直到珠子干燥，加21μl水洗脱，放置1min后，将上清液转移到新的1.5ml低吸附管。