[发明专利]一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备甘露糖中的应用

权利要求书

1.一种磷酸酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第175位、179位或195位进行单位点突变获得的。

2.如权利要求1所述突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列突变为下列之一：第175位丝氨酸突变为天冬酰胺、第179位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸或半胱氨酸、第195位酪氨酸突变为亮氨酸。

3.一种权利要求1所述磷酸酶突变体的编码基因。

4.一种权利要求3所述磷酸酶突变体编码基因构建的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述磷酸酶突变体在催化麦芽糊精生产甘露糖中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含磷酸酶突变体编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体用缓冲液重悬后超声破碎、离心，上清液在60-80℃水浴中热处理10-30min后再次离心的上清液作为催化剂，以麦芽糊精为底物，添加MgCl₂和磷酸盐，联合葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶和甘露糖6-磷酸异构酶，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50～70℃条件下反应8～48h，冰浴终止反应，获得含甘露糖的反应液，反应液分离纯化，获得甘露糖。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物加入终浓度为5-50g/L，所述催化剂加入终浓度以蛋白含量计为20-200μg/mL；所述葡聚糖磷酸化酶加入终浓度为100-300μg/mL；所述葡萄糖磷酸变位酶加入终浓度为10-100μg/mL；所述葡萄糖磷酸异构酶加入终浓度为10-150μg/mL；甘露糖6-磷酸异构酶加入终浓度为10-150μg/mL；所述MgCl₂加入终浓度为5-50mM；所述磷酸盐加入终浓度为5-50mM。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下步骤制备：将含磷酸酶突变体编码基因的工程菌接种至含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养12h后，将菌液以体积浓度10％接种量转接至新的含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃、180rpm培养至OD600为0.6-0.8时，降温至28℃，加IPTG至终浓度0.1mM，诱导表达12h；将诱导培养菌液离心，弃上清，沉淀用pH 7.2的HEPES缓冲液重悬，即为菌体悬液；菌体悬液在60W下超声破碎15min，持续2s，间歇4s，获得细胞破碎液，离心，上清液在60-80℃水浴中热处理10-30min，离心后的上清液即为酶液。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶和甘露糖6-磷酸异构酶均以含相应酶编码基因的重组菌发酵培养获得的湿菌体用缓冲液重悬，超声破碎、离心，上清液在60-80℃水浴中热处理10-30min后再次离心的上清液形式加入。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述上清液按如下方法制备：分别构建含葡聚糖磷酸化酶编码基因，葡萄糖磷酸变位酶编码基因，葡萄糖磷酸异构酶编码基因和甘露糖6-磷酸异构酶的重组大肠杆菌工程菌，分别接种至LB液体培养基中，37℃、200r/min培养12h后；将菌液以体积浓度10％的接种量转接至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、180r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至28℃，加IPTG至终浓度0.02mM，28℃诱导表达12h；将诱导培养菌液离心；弃上清，沉淀用pH 7.2、100mM的HEPES缓冲液重悬，即为菌体悬液；菌体悬液采用超声破碎仪，在4℃冰浴、超声功率60W、超声破碎2s、间歇4s的条件下，超声连续破碎10-30min，获得细胞破碎液，离心，上清在60-80℃水浴下热处理10-30min，离心，取上清液。