[发明专利]一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备甘露糖中的应用

说明书

本发明公开了一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备甘露糖中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第175位、179位或195位进行单点突变获得的。本发明以含磷酸酶突变体编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎提取的酶液为催化剂，以麦芽糊精为底物，联合葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、甘露糖6‑磷酸异构酶，添加MgCl₂和磷酸盐，以pH为7.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，制备甘露糖。本发明磷酸酶突变体F179M通过体外一锅法以麦芽糊精为底物生产甘露糖，转化率达到60‑70％，产物甘露糖与副产物果糖、葡萄糖比例为11:1:1。

(一)技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种大西洋嗜热菌(Thermosiphoatlanticus)来源的对甘露糖-6-磷酸特异性提高的磷酸酶突变体及其在体外多酶合成甘露糖中应用。

(二)背景技术

体外多酶合成系统是模仿体内代谢途径，在体外组合一系列酶及辅酶构建生化反应途径，催化底物高效合成产物的新型生物制造方法。通过酶元件、多酶复合体的体外设计与组装调控，构建崭新的人工生物合成途径，重塑自然生产线，具有途径多样、高度可控、高效率和高原子经济性等显著优势，对变革化学品的制造模式产生具有重要意义。近年来，体外多酶合成体系在肌醇等功能性糖醇化学品合成中得到了重要应用。

从麦芽糊精出发，构建体外多酶合成体系是生产甘露糖的重要方法。在此途径中，磷酸酶作为催化甘露糖-6-磷酸去磷酸化合成甘露糖的关键酶，其催化性能直接影响甘露糖合成效率。但是目前发现的多个磷酸酶，均有着广泛的底物谱，即可催化各种磷酸单糖如葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸的去磷酸化，导致在催化甘露糖6-磷酸生产甘露糖过程中产生大量的副产物，产率降低，导致后续产物分离纯化困难。因此，磷酸酶底物专一性的调控对高纯度甘露糖的合成具有重要意义。本发明筛选挖掘了大西洋嗜热菌(Thermosiphoatlanticus)来源磷酸酶(M6PP)，并通过基因工程技术，对该酶进行了改造，对其底物专一性进行调控，以获得理想突变体，对甘露糖6-磷酸具有严格的专一性，实现甘露糖的体外高效合成。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种大西洋嗜热菌(T.atlanticus)来源的底物专一性提高的磷酸酶突变体，重组菌及在催化麦芽糊精制备甘露糖中的应用。本发明的磷酸酶突变体可以在60℃下体外联合多酶催化麦芽糊精合成甘露糖，具有高度的底物特异性，副产物大量减少，目标产物产率提高。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种磷酸酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2)的第175位、179位或195位进行单位点突变获得的；优选突变体为下列之一：第175位丝氨酸Ser突变为天冬酰胺Asn(S175N，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)，第179位苯丙氨酸Phe突变为甲硫氨酸Met(F179M，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)、第179位苯丙氨酸Phe突变为半胱氨酸Cys(F179C，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示)、第195位酪氨酸Tyr突变为亮氨酸Leu(Y195L，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)。

SEQ ID NO.1：

MVFVFDLDGTLLKKDNTISPNMVALIKRLDKNNHRIVFASGRMLISIRKIVEKYFQKMFPIIAYNGAMVFIPNKGIIFEKTLDFQTSKEIIELLRNKNIHRQAYINDELFSEEDNENIKFYSRHAGVEYKVVEDLIELIKHKNSTKLLAIDSPMKLDKLKEELENLNLNAEIFKSMNIFLDIVPKDVNKAIALKYLLKTLKAEHEKLIVFGDNHNDIPLFKFADFSIAVGNAVTELKKIADFVSKTNDEDGVYYALTEKFPEFLKE。