[发明专利]一种通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法

权利要求书

1.一种通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于：首先利用分子印迹选择性识别模板的特性，制备了一种新冠病毒N蛋白选择性吸附材料，进而用于利用此材料富集环境中新冠病毒N蛋白及其相连核酸，对富集核酸进行提取后再通过逆转录PCR方法检测环境中存在的新冠病毒；该新冠病毒N蛋白选择性吸附材料是以以新冠病毒N蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备得到。

2.根据权利要求1所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于：新冠病毒N蛋白选择性吸附材料结构为内外两层，内层为碳纳米管，外层为聚丙烯酰胺聚合层，聚丙烯酰胺聚合层中镶嵌有病毒表面蛋白印迹；新冠病毒N蛋白选择性吸附材料的直径为10-30nm，丙烯酰胺的质量占比为20％～25％；新冠病毒N蛋白选择性吸附材料对新冠病毒表面蛋白的吸附量达88-140g/g，吸附动力学速率常数达0.00015-0.00025/s。

3.根据权利要求1或2所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于具体步骤如下：

1)将羧基化碳纳米管CNTs-COOH溶于水分散为稳定悬浊液，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和碳二亚胺盐酸盐EDAC振荡后离心，清洗后得到沉淀；

CNTs-COOH和NHS的质量比在(3～12):1，CNTs-COOH和EDAC的质量比在(5～20):1；

2)将步骤1)中的沉淀加入含新冠病毒N蛋白的缓冲溶液充分振荡，加入三羟甲基氨基甲烷Tris溶液，振荡后离心，清洗后得到沉淀，CNTs-COOH和新冠病毒N蛋白的质量比在(25～100):1；CNTs-COOH和Tris的质量比为(0.1～0.5):1；

3)将步骤2)中的沉淀重悬后，加入丙烯酰胺AAM充分振荡，随后加入N,N’-亚甲基双丙烯酰胺NNMBA和硫代硫酸盐，振荡2-8小时后离心，清洗后得到沉淀，CNTs-COOH和AAM的质量比在(0.5～2):1；CNTs-COOH和NNMBA的质量比在(0.2～1):1；CNTs-COOH和硫代硫酸盐的质量比在(3～15):1；

4)将步骤3)中的沉淀加入弱酸溶液振荡3-12h后充分清洗，干燥后得到新冠病毒N蛋白选择性吸附材料MIP；

5)将步骤4)中制备的MIP浸入待检测的环境样本中搅拌10-30min后离心将MIP分离；随后将离心获得的MIP加入至市售RNA提取试剂盒提取富集的新冠病毒核酸；将提取的新冠病毒核酸通过市售逆转录PCR试剂盒扩增，检测新冠病毒的含量；加入至环境样本中的MIP的浓度为100-1000mg/L。

4.根据权利要求3所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于步骤1)中的CNTs-COOH悬浊液的浓度为2-20mg/mL。

5.根据权利要求3所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于步骤2)中的缓冲溶液为任何能使蛋白质稳定存在的溶液，包括但不限于PIPES缓冲溶液或PBS缓冲溶液，浓度为0.01-1mol/L；新冠病毒N蛋白的浓度为200-300mg/L。

6.根据权利要求3所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于步骤3)中硫代硫酸盐为硫代硫酸钠、硫代硫酸钾或硫代硫酸铵。

7.根据权利要求3所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于步骤4)中的弱酸为草酸或乙酸，浓度为0.5～2mol/L。

8.根据权利要求3所述的通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，其特征在于步骤5)中环境样本为水、土壤或空气样本，其中土壤或空气样本需首先将样本浸入水中使新冠病毒转移到水相后测定。