[发明专利]一种通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法

说明书

一种通过选择性吸附核蛋白富集游离核酸的新冠病毒检测方法，首先以新冠病毒N蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备新冠病毒蛋白选择性吸附材料，用于富集环境中新冠病毒N蛋白及其相连核酸，对富集核酸进行提取后再通过逆转录PCR方法检测新冠病毒。本发明材料对新冠病毒蛋白具有较高的吸附能力，吸附量达88‑140mg/g材料，可用于空气和水体等环境中新冠病毒的选择性吸附。对新冠病毒蛋白一级动力学速率常数达0.00015‑0.00025/s，因此能在短时间吸附足够的新冠病毒蛋白用于后续的检测。并且灵敏度远高于常规的核酸检测方法，灵敏度是后者的65‑1000倍。

技术领域

本发明涉及一种选择性吸附核蛋白(N蛋白)的功能材料的制备及其用于环境中低浓度新冠病毒的检测方法；该功能材料利用分子印迹选择性识别模板的特性制备，能够选择性吸附环境中的新冠病毒N蛋白，同时富集与N蛋白相连的新冠病毒游离核酸，通过对N蛋白和核酸的后续检测分析，以实现环境中新冠病毒的高效检测。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情在全球的蔓延已经波及绝大多数国家和地区，感染人数已达一亿八千万，为公共健康和人类发展带来巨大灾难。除在人群中感染，在环境样品中检出新冠病毒的情况逐渐增加，环境中新冠病毒再次感染人群的案例也越来越多，已经成为新冠病毒传播的一种主要形式。因此，开展环境中新冠病毒的检测至关重要。

当前新冠病毒检测手段主要针对人体，包括核酸检测方法，免疫学检测方法和病毒分离鉴定等。核酸检测准确率很高，在感染早期即可呈现阳性，但检测程序复杂、费时，对于样品的保存，核酸提取，操作人员的熟练程度以及操作环境都有较高的要求。酶联免疫吸附剂测定法是利用抗原与抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，如专利“一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法”(申请号CN202011460161.0)公开了一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括各自独立包装的试剂1与试剂2，试剂2至少包括包被有新冠蛋白的胶乳微粒，用于与被测样本中的新型冠状病毒抗体发生抗原抗体反应。但该方法准确率受限且检测较慢，常不能实现早期诊断。病毒分离方法需要数天培养，特异性和敏感性都会低于核酸检测法。而且，上述方法都主要用于人体中新冠病毒的检测，而环境中新冠病毒普遍浓度很低，而且污染介质复杂、影响因素众多，导致上述方法的可用性进一步降低。开发一种简便、快速、识别能力强、灵敏度高，适用于环境中新冠病毒检测的方法有着重要意义。

发明内容

本发明的目的在于制备一种选择性吸附新冠病毒核蛋白(N蛋白)的功能材料，并利用其检测环境中低浓度新冠病毒。该材料对新冠病毒N蛋白具有较高的吸附能力和特异性，能够有效富集环境中的新冠病毒N蛋白及其相连核酸，实现对环境中低浓度新冠病毒的特异性检测。本发明的技术方案为：首先以新冠病毒N蛋白为模板，以羧基化的碳纳米管为载体，以丙烯酰胺为功能单体通过聚合反应制备新冠病毒蛋白选择性吸附材料，用于富集环境中新冠病毒N蛋白及其相连核酸，对富集核酸进行提取后再通过逆转录PCR方法检测新冠病毒。具体方案如下：

1)将羧基化碳纳米管(CNTs-COOH)溶于去离子水，超声分散为稳定悬浊液，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺盐酸盐(EDAC)振荡后离心后清洗沉淀；CNTs-COOH和NHS的质量比在(3～12):1，CNTs-COOH和EDAC的质量比在(5～20):1；

2)将步骤1)中的沉淀溶于含市售新冠病毒表面蛋白的缓冲溶液，2～8℃下充分振荡，加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液，充分振荡后离心，去离子水清洗沉淀；CNTs-COOH和新冠病毒表面蛋白的质量比在(25～100):1；CNTs-COOH和Tris的质量比为(0.1～0.5):1；