[发明专利]一种软骨组织消化方法

说明书

本发明提出了一种软骨组织消化方法，包括：取软骨组织；将所述软骨组织处理成碎片；在所述碎片中加入胶原酶溶液，预消化1‑2小时；收集上清，提取细胞，用无菌PBS冲洗剩余的软骨碎片，重新加入胶原酶原液，进行二次消化，每次2‑3小时；之后收集上清，提取细胞；重复所述二次消化步骤，直至所述碎片消化完全后得到所需要的细胞数量为止。本发明的方法实现软骨组织的充分消化，并且具有高提取效率、高细胞活性、高细胞纯度。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是指一种软骨组织消化方法。

背景技术

软骨是一种乏血管组织，主要由软骨细胞和富含糖胺聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的的细胞外基质构成。当软骨受损时，由于细胞密度低，缺乏血供，细胞向受损区域的迁移率低，导致软骨的修复能力有限。胶原酶消化是分离软骨细胞最常用的方法，胶原酶从外向内分解软骨，将软骨细胞从软骨基质中释放出来。但是对于不同的软骨类型，消化的方案有很大区别。

一般来说，传统方案是进行一步胶原酶消化：软骨样品在胶原酶溶液中消化一段时间(一般为10-22小时，通常为12小时以上)，然后收集上清液，离心获得软骨细胞。该过程中不更换酶溶液，不提取酶溶液中的细胞。该种方法存在以下问题：

(1)现有技术主要是一步消化法，耗时长，消化不彻底；

(2)细胞提取效率低：胶原酶长时间作用后，酶活性下降，不能很好的分解深部的软骨组织；

(3)细胞活性低：已被消化分离出的细胞长时间存在于胶原酶溶液中，损害了细胞的活性；

(4)细胞纯度低：软骨表面有软骨膜组织，难以完全剥离；在消化细胞时，软骨膜细胞与软骨细胞混杂在一起，难以区分，导致软骨细胞纯度较低。

有鉴于此，有必要研发一种软骨组织消化方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明提出一种软骨组织消化方法，解决了现有技术中消化不彻底、低细胞产率、低细胞活性、细胞纯度低的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种软骨组织消化方法，包括：

取软骨组织；

将所述软骨组织处理成碎片；

在所述碎片中加入胶原酶溶液，预消化1-2小时；收集上清，提取细胞，用无菌PBS冲洗剩余的软骨碎片，重新加入胶原酶原液，进行二次消化2-3小时；之后收集上清，提取细胞；

重复所述二次消化步骤，直至所述碎片消化完全后得到所需要的细胞数量为止。

在一些实施例中，所述二次消化步骤进行三次以上。

在一些实施例中，所述软骨组织为兔软骨组织。

在一些实施例中，所述兔软骨组织为兔耳软骨组织、兔肋软骨组织、兔鼻中隔软骨组织或兔膝关节软骨组织。

在一些实施例中，所述兔软骨组织取自体重为0.7-1.0千克的白兔。

在一些实施例中，所述软骨组织先进行下述处理：

所述软骨组织在氯霉素溶液中浸泡20-40分钟，用无菌PBS溶液清洗。

在一些实施例中，所述胶原酶溶液为将NB4胶原酶(Nordmark Biochemicals，德国)溶解于Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM，Gibco，USA)。

在一些实施例中，所述胶原酶溶液的终浓度为1.5mg/mL。

在一些实施例中，消化过程在37℃，5％二氧化碳，100r/min的恒温摇床中进行。