[发明专利]适用于冷冻组织的单细胞核提取方法在审
| 申请号： | 202110855298.4 | 申请日： | 2021-07-28 |
| 公开（公告）号： | CN113293196A | 公开（公告）日： | 2021-08-24 |
| 发明（设计）人： | 訾晓渊;尤园园;朱文奇;丁修恒 | 申请（专利权）人： | 新格元（南京）生物科技有限公司;南京通元医学检验实验室有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12N15/10 |
| 代理公司： | 南京智造力知识产权代理有限公司 32382 | 代理人： | 朱旭;汪丽红 |
| 地址： | 210018 江苏省南京市江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 适用于 冷冻 组织 细胞核 提取 方法 | ||
1.一种冷冻组织的单细胞核提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）取冻存组织至无菌离心管中，置于冰浴中，加入少量预冷的NEBCS核分离液后立即将冷冻组织剪碎，再次加入NEBCS核分离液，冰上孵育；
（2）孵育结束后，过滤器过滤至离心管中，用PBS-RI缓冲液冲洗过滤器；第一次离心后取上清液再次离心，充分去除上清液；加入PBS-RI缓冲液重悬细胞核沉淀，加入DAPI细胞核染液混匀后黑暗中静置； PBS-RI缓冲液清洗细胞核，离心去除上清液，用PBS-RI缓冲液重悬细胞核，稀释后得到细胞核悬液；步骤（1）中所述的NEBCS核分离液的组成成分包含有0.32M蔗糖，5 mM CaCl2，3 mM Mg(Ac)2，0.1 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，0.05%~0.08%TritonX-100，5 mM ~8mM DTT，0.2 U/μL RNase inhibitor。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）中所述的孵育时间为5~10min。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中所述过滤器直径为40~50um。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中所述PBS-RI缓冲液中含有终浓度为5 mM DTT和 0.02 U/μL的RNase inhibitor。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中所述第一次离心的转速为100~300 rcf，离心时间1 ~ 3min；再次离心的转速为500 rcf， 离心时间为5 min。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中所述细胞核悬液的浓度为3~5×105 nucleus/mL。
7.一种NEBCS核分离液，其特征在于，所述的NEBCS核分离液为优化后的NEB核分离液，其组成成分包含有0.32 M蔗糖，5 mM CaCl2，3 mM Mg(Ac)2，0.1 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，0.05%~0.08%Triton X-100，5 mM~8mM DTT，0.2 U/μL RNase inhibitor。
8.一种单细胞核测序方法，其特征在于，根据权利要求1~6任一项所述的提取方法提取细胞核，对细胞核进行单细胞组学分析。
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