[发明专利]适用于冷冻组织的单细胞核提取方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及适用于冷冻组织的单细胞核提取方法。本发明使用NEBCS核分离液在较短时间内从冷冻组织中成功分离提取单细胞核，并通过差速离心获得较为纯净的单细胞核。大大降低了细胞核RNA降解的比例，使得单细胞水平能够获得更高比例的蛋白编码RNA，并且有效降低了线粒体基因占比。本发明所提供的单细胞核提取方法适用多种类型冷冻组织，有效防止RNA法进一步降解。且操作过程简单，利用离心机及显微镜等常见实验室仪器即可完成细胞核的提取工艺，整个过程仅需30‑60min。无需特殊仪器设备，有效降低提取成本，具有很强的实用性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及适用于冷冻组织的单细胞核提取方法。

背景技术

单细胞全转录组测序技术是在单细胞水平对全转录组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全转录组RNA进行扩增后进行高通量测序，是研究复杂组织中细胞类型、动态和功能过程的工具。与传统的转录组测序相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达，其优势是全方位和多层次的。然而，很多珍贵人体组织样本是以冷冻组织形式保存，通过酶解法消化后获得的活细胞极少，无法用于单细胞转录组测序。目前，通过机械抽提细胞核可以攻克冷冻组织测序的难题且有许多明显优势，但是现有的机械抽提方法提取细胞核流程较为繁琐，且对试剂仪器等要求比较高，如需要用到碘克沙醇或使用流式细胞仪分选细胞核等，普通实验室可能无法展开实验，且大大的增加细胞核抽提成本。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种适用于冷冻组织的单细胞核提取方法。本发明所提供的单细胞核提取方法最大程度减少RNA的降解，并且解决了现有从冷冻组织中进行单细胞核提取所存在的操作时间长、流程繁琐、成本高等问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种冷冻组织的单细胞核提取方法，所述方法包括以下步骤：

（1）取冻存组织至无菌离心管中，置于冰浴中，加入少量预冷的NEBCS核分离液后立即将冷冻组织剪碎，再次加入NEBCS核分离液，冰上孵育；

（2）孵育结束后，过滤器过滤至离心管中，用PBS-RI缓冲液冲洗过滤器；第一次离心后取上清液再次离心，充分去除上清液；加入PBS-RI缓冲液重悬细胞核沉淀，加入DAPI细胞核染液混匀后黑暗中静置； PBS-RI缓冲液清洗细胞核，离心去除上清液，用PBS-RI缓冲液重悬细胞核，稀释后得到细胞核悬液。

进一步地，步骤（1）中所述的NEBCS核分离液的组成成分包含有0.32M蔗糖，5 mMCaCl₂，3 mM Mg(Ac)₂，0.1 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，0.05%~0.08% Triton X-100，5 mM ~8mM DTT , 0.2 U/μL RNase inhibitor。

步骤（1）中所述的孵育时间为5~10min。

步骤（2）中所述过滤器直径为40~50um。

步骤（2）中所述PBS-RI缓冲液中含有终浓度为5 mM DTT和 0.02 U/μL的RNaseinhibitor。

作为优选地，所述的PBS-RI缓冲液在使用前于4℃环境中预冷。

步骤（2）中所述第一次离心的转速为100~300 rcf，离心时间1 ~ 3min；再次离心的转速为500 rcf， 离心时间为5 min。

步骤（2）中所述细胞核悬液的浓度为3~5×10⁵ nucleus/mL。