[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂及其筛选方法、以及其应用

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述3C样蛋白酶抑制剂包括诃子酸及其同分异构体、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、曲克芦丁、柠檬酸酯B、芹菜素-7-O-(2G-鼠李糖)龙胆糖苷、brutieridin、Heraclenol 3'-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside、Procyanidin B2 3,3'-di-O-gallate、柠檬酸酯A和苯甲酸苯甲醇葡萄糖酚苷中的至少一种。

2.一种如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10、以猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶为靶点，以小分子数据库为筛选对象，将所述小分子数据库中的所有分子与所述3C样蛋白酶的活性区域进行分子对接，筛选得到亲和力排名前50～150的天然分子；

S20、将筛选得到的所述天然分子在细胞外和/或细胞内进行生物活性筛选，得到3C样蛋白酶抑制剂；

其中，所述小分子数据库包括ZINC15数据库。

3.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述小分子数据库为所述ZINC15数据库中的天然分子库。

4.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤S10包括：

S11、将所述小分子数据库中的所有分子与所述3C样蛋白酶的活性区域使用AutodockVina进行对接，初步筛选得到亲和力排名前9000～14000的初筛分子；

S12、再使用Discovery studio将所有所述初筛分子与所述3C样蛋白酶进行柔性对接，精筛得到亲和力排名前50～150的天然分子。

5.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤S20包括：

S21、用荧光共振能量转移系统检测3C样蛋白酶抑制剂在细胞外的活性；和/或，

S22、用双荧光酶报告系统检测3C样蛋白酶抑制剂在细胞内的活性。

6.如权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤S21包括：

S210、根据3C样蛋白酶切割猪流行性腹泻病毒的复制酶多聚蛋白ppla和pplb的位点，合成修饰多肽Dabcyl-YNSTLQ↓AGLRKM-E-Edans，所述修饰多肽可被3C样蛋白酶切割，以使E-Edans的荧光信号被释放出来；

S211、向所述修饰多肽加入所述3C样蛋白酶、所述3C样蛋白酶抑制剂和缓冲液，在340nm激发光条件下，检测480nm处的发射光强度，以检测所述3C样蛋白酶抑制剂的活性。

7.如权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤S22包括：

S220、将3C样蛋白酶切割多肽与萤火虫荧光素酶融合表达，并插入内含肽DnaE，得到环化报告质粒；

S221、将所述环化报告质粒、海肾荧光素酶质粒、以及表达所述3C样蛋白酶的质粒共转染293T细胞，转染后5～7h更换含有所述3C样蛋白酶抑制剂的维持液，转染后20～28h用双荧光素酶检测试剂盒检测3C样蛋白酶的切割活性。

8.一种抗猪流行性腹泻病毒的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括3C样蛋白酶抑制剂，所述3C样蛋白酶抑制剂为如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的3C样蛋白酶抑制剂。