[发明专利]一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法

权利要求书

1.一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，设计覆盖细菌的16S与真菌的ITS基因待测区域的自主设计的引物，序列为SEQ01-04；

步骤二，在SEQ01-04的正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，得到第二轮扩增时与Barcode引物退火时相结合的序列，将第二轮扩增时与Barcode引物退火时相结合的序列混合形成引物池；

步骤三，接收样本，提取DNA；

步骤四，采用引物池进行第一轮扩增，纯化；再选用Barcode进行第二轮扩增，纯化；

步骤五，构建最终文库；

步骤六，将最终文库进行纳米孔测序，分析确认样本感染的病原微生物。

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，其特征在于，步骤二中所述第二轮扩增时与Barcode引物退火时相结合的序列按照浓度比例1：1：1：1混合形成引物池。

3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，其特征在于，所述样本包括：肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液或EDTA抗凝血。

4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤四中第一轮扩增的反应体系包括：2*PCR mix 12.5μL，引物池3μL，模板DNA 9.5μL；反应程序为：105℃ 热盖；95℃ 3min；95℃ 30sec，62℃ 1min，72℃ 1min，25个循环；72℃ 3min ；4℃ Hold；

纯化采用磁珠纯化。

5.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤四中第二轮扩增的反应体系包括：2*PCRmix 12.5μL，Barcode引物3μL，第一轮扩增纯化产物10.5μL；反应程序为：105℃ 热盖；95℃ 3min；95℃ 30sec，64℃ 30 sec，72℃1min，12个循环；72℃ 3min ；4℃ Hold；

纯化采用磁珠纯化。

6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，其特征在于，步骤五中构建最终文库的具体方法是：

（1）文库pooling，得到文库Mix DNA；

（2）末端修复：

末端修复反应体系为：End prep mix4 15μL，文库Mix DNA XμL，ddH₂O 50-XμL；PCR程序为：105℃ 热盖，25℃ 15min，65℃ 15min，4℃ Hold；

（3）磁珠纯化；

（4）接头连接：

接头连接反应体系为：上一步的DNA样本 25μL，连接缓冲液10μL，Rapid DNA Ligase 5μL，Adapter Mix 1μL，ddH2O 9μL；PCR程序为：105℃ 热盖；20℃ 15min；4℃ Hold；

（5）磁珠纯化；

（6）产物质检；

（7）最终文库配置体系为：Sequencing Buffer 18.8μL，Loading Beads 12.8μL，library XμL，ddH₂O 15.4-XμL。

7.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，其特征在于，步骤六中纳米孔测序使用Nanopore公司的MinION测序仪，测序试剂盒：SQK-LSK109，测序芯片：R9。

8.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，其特征在于，步骤六中将最终文库进行纳米孔测序，分析确认样本感染的病原微生物的具体步骤是：

a）芯片上机前质检；

b）诱发：

诱发剂配置体系为：Flush Buffer 500μL，Flush Tether 15μL，ddH2O 200μL；

c）加样；

d）测序；

e）下机数据分析：

下机数据与数据库中的序列进行比对，分析每个样本中各种菌株的丰度，确认样本感染的病原微生物。