[发明专利]一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，属于分子生物学领域，鉴定方法包括如下步骤：步骤一，设计覆盖细菌的16S与真菌的ITS基因待测区域的自主设计的引物，序列为SEQ01‑04；步骤二，将第二轮扩增时与Barcode引物退火时相结合的序列混合形成引物池；步骤三，接收样本，提取DNA；步骤四，第一轮扩增，纯化；第二轮扩增，纯化；步骤五，构建最终文库；步骤六，将最终文库进行纳米孔测序，分析确认样本感染的病原微生物；通过本发明设计的覆盖细菌的16S与真菌的ITS基因待测区域的引物组合再结合新型纳米孔测序法，能够实现感染性疾病病原微生物的快速临床诊断，具备高通量，快速检测的优势。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法。

背景技术

临床上有大量的病例需要进行感染病原菌的检测，其中每年至少有50万例为重症感染病人。目前，临床检测病原微生物主要通过传统的细菌培养鉴定方法，其过程包括微生物的培养及分离、物种鉴定及药敏试验。传统的病原检测方法存在病原周期长，检测覆盖度低，部分病原无法检测或需要很长时间才能检出，以及无法得到病原的丰度信息等局限性。近年来，高通量基因测序技术的发展，使得我们能够直接从患者的脑脊液、胸水、腹水、肺泡灌洗液等样本中提取核酸，短时间内一次性检测样本中几乎所有潜在的病原体。

但是市场上的检测方法还是不能检测出较低丰度的致病微生物，且为了检测细菌种类的覆盖率高，需要大量时间，市场需要一种能够降低测序时间的方法，本发明通过找到覆盖细菌的16S与真菌的ITS基因待测区域的自主设计的引物和新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）技术解决以上问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，本发明通过设计覆盖细菌的16S与真菌的ITS基因待测区域的引物组合并结合新型纳米孔测序法，实现快速进行微生物的基因组比对和种属鉴定，便于实现感染性疾病病原微生物的快速临床诊断，使该检测方法具备高通量，快速检测的优势。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，包括如下步骤：

步骤一，设计覆盖细菌的16S与真菌的ITS基因待测区域的自主设计的引物，序列为SEQ01-04；

步骤二，在SEQ01-04的正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，得到第二轮扩增时与Barcode引物退火时相结合的序列，将第二轮扩增时与Barcode引物退火时相结合的序列混合形成引物池；

步骤三，接收样本，提取DNA；

步骤四，采用引物池进行第一轮扩增，纯化；再选用Barcode进行第二轮扩增，纯化；

步骤五，构建最终文库；

步骤六，将最终文库进行纳米孔测序，分析确认样本感染的病原微生物。

前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，步骤二中所述第二轮扩增时与Barcode引物退火时相结合的序列按照浓度比例1：1：1：1混合形成引物池。

前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，样本包括：肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液或EDTA抗凝血。

前述的一种基于纳米孔测序仪的微生物快速鉴定方法，步骤四中第一轮扩增的反应体系包括：2*PCR mix 12.5μL，引物池3μL，模板DNA 9.5μL；反应程序为：105℃ 热盖；95℃ 3min；95℃ 30sec，62℃ 1min，72℃ 1min，25个循环；72℃ 3min ；4℃ Hold；

纯化采用磁珠纯化。