[发明专利]一种基于噻唑烷化学可逆反应富集早期糖化肽段的方法

权利要求书

1.一种基于噻唑烷化学可逆反应富集早期糖化肽段的方法，其特征是，利用合成的1,2-氨基硫醇修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys对氧化后的早期糖化肽段进行选择性富集，实现特异性的高效分离，从而增加质谱分析鉴定的覆盖度，其包括步骤：

1)合成1,2-氨基硫醇修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys；

2)对糖化肽段中的还原糖进行温和氧化；

3)利用噻唑烷可逆反应富集早期糖化肽段，并利用高分辨质谱仪进行分析。

2.按照权利要求1所述的基于噻唑烷化学可逆反应富集早期糖化肽段的方法，其特征是，通过在Fe₃O₄磁核表面修饰半胱氨酸衍生物(Boc-Cys(Trt)-NHS)，在ACN和DIEA反应体系中制备得到富集载体1,2-氨基硫醇修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys。

3.按照权利要求1所述的基于噻唑烷化学可逆反应富集早期糖化肽段的方法，其特征是，利用比例为4：2：1的氯化烯丙基钯二聚物、TCEP和MPAA的6M Gnd.HCl，PH 5～9作为催化剂将偶联到富集载体上的糖化肽段高效解离。

4.按照权利要求1所述的基于噻唑烷化学可逆反应富集早期糖化肽段的方法，其特征是，将早期糖化肽段进行氧化后，在5mM TCEP、10mM NH₄Ac的50％ACN/50％H₂O溶液中与1,2-氨基硫醇修饰的磁性纳米粒子Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys共同孵育实现偶联；清洗磁球除去非特异性肽段后，使用权利要求3所述的解离条件将偶联到富集载体上的糖化肽段进行解离，磁选分离出上清液，除盐，冻干后复溶在A相(98％ACN、2％H₂O、0.1％FA)中，进行质谱分析。

5.按权利要求1所述的基于噻唑烷化学可逆反应富集早期糖化肽段的方法，其特征是，所述的磁性纳米材料结合噻唑烷可逆反应用于富集糖化肽段中，其富集糖化肽段的方法包括：

以合成的带有糖化修饰的肽段Ac-AIYPVIPK(g)VLHPR作为标准修饰肽段，其中小写字母g代表糖化位点，用Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys作为富集材料进行特异性富集，测试富集效果；

以标准合成肽段Ac-AIYPVIPK(g)VLHPR与马心肌红蛋白MYO酶解肽段的混合物作为模型测试Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys的选择性；

以标准合成肽段Ac-AIYPVIPK(g)VLHPR，在逐渐降低肽段样品起始量的情况下用相同质量的Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys进行富集，测试材料的富集检测限；

以外源糖化标准蛋白(马心肌红蛋白，人源血红蛋白)为样品，酶解后，使用Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys进行富集，测试Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys的富集效果，包括糖化肽段的鉴定数目和糖化位点的鉴定数目；

用外源糖化的小鼠血浆/人血清作为复杂的生物样品，对酶解后得到的肽段进行富集，测试Fe₃O₄@PGMA-DETA-Cys用于富集复杂实际样品中的糖化肽段的可行性。