[发明专利]石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用

权利要求书

1.石墨烯修饰的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

对金电极进行清洁预处理；

将核苷酸序列固定在金电极上并用巯基己醇对核苷酸序列未与金电极结合部分进行封闭，得到固定有核苷酸序列的金电极；

将所得固定有核苷酸序列的金电极进行甲基化敏感型限制性核酸内切酶处理，利用末端转移酶延伸，并浸入含有氧化石墨烯的缓冲液中充分作用，得到石墨烯修饰的电化学生物传感器。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核苷酸序列为含有CpG序列5'-CCGG-3'，且所述核苷酸序列两端修饰有巯基。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将核苷酸序列固定在金电极上并用巯基己醇对核苷酸序列未与金电极结合部分进行封闭具体为：

将核苷酸序列液与三(2-羧乙基)膦混合均匀，加入干燥的金电极，室温下浸泡10-12小时后，取出，干燥，得到固定有核苷酸序列的金电极；

将固定有核苷酸序列的金电极浸入巯基己醇溶液中，室温下浸泡1-2小时，以封闭核苷酸序列未与金电极结合部分。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所加入的核苷酸序列液的浓度为1μM，三(2-羧乙基)膦的浓度为10mM。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将将所得固定有核苷酸序列的金电极进行甲基化敏感型限制性核酸内切酶处理，利用末端转移酶延伸，并浸入含有氧化石墨烯的缓冲液中充分作用的步骤具体为：

将所得固定有核苷酸序列的金电极浸入含有甲基化敏感型限制性核酸内切酶的10mM第一Tris-HCl缓冲溶液中，于温度36-38℃处理60-70分钟，得到第一中间电极；

将所得中间电极用PBS缓冲液冲洗后，随即浸入含有40U/mL TdTase和10μM dNTP或dATP的20mM第二Tris-HCl缓冲液中，于36-38℃下处理60-70分钟，得到第二中间电极；

将所得第二中间电极冲洗后，浸入含有100ppm氧化石墨烯的20mM第二Tris-HCl缓冲液中，于温度36-38℃处理60-70分钟，得到石墨烯修饰的电化学生物传感器。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一Tris-HCl缓冲溶液的pH＝7.4，由50mM NaCl、10mM MgCl₂、1mM DTT组成，所述第二Tris-HCl缓冲溶液的pH＝7.4，由50mM NaCl、10mM MgCl₂组成。

7.根据权利要去1-6任一项所述的制备方法制备得到的石墨烯修饰的电化学生物传感器。

8.根据权利要求7所述的石墨烯修饰的电化学生物传感器在甲基化转移酶检测中的应用，其特征在于，其能够在0.7-12U/mL范围内对甲基化转移酶进行检测。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，应用时，在检测的缓冲体系中存在有甲基化转移酶时，其能够催化金电极上固定的核苷酸序列中的CpG序列5'-CCGG-3'甲基化，导致甲基化敏感型限制性核酸内切酶无法进行催化及后续反应，所检测得到的经甲基化转移酶修饰过的电极阻抗会明显大于石墨烯修饰的电化学生物传感器的电极阻抗，以达到检测目的。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在检测时，将所得固定有核苷酸序列的金电极浸入含有甲基化转移酶的10mM第三Tris-HCl缓冲液中于温度36-38℃甲基化75-85分钟；

其中，所述第三Tris-HCl缓冲液的pH＝7.4，由50mM NaCl、10mM MgCl₂、1mM DTT和160μMSAM组成，所加入的甲基化转移酶的浓度为40U/mL。