[发明专利]石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用

说明书

本发明提出一种石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用，属于生物传感器技术领域。本发明提出的生物传感器在整个过程中可只利用一段DNA序列修饰金电极表面，并且不需要对DNA进行额外的任何修饰。该传感器体系稳定，操作简单，可便捷快速地对待检溶液中的甲基化转移酶以定性、定量的方式进行判断，实现甲基化转移酶检测限可达0.7U/mL。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，尤其涉及一种石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

甲基化使甲基从CpG二核苷酸中的腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到胞嘧啶的C-5位置。DNA甲基化是DNA甲基化转移酶(methyl transferase，DNMT)参与的一种化学修饰过程，在DNMT催化下，通过S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基，将甲基转移到相应碱基上。

在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG岛5'端胞嘧啶上，生成为5'甲基胞嘧啶。CpG岛为富含G、C碱基的DNA区域，主要位于基因的启动子。人类的CpG以2种形式存在，在正常组织中，一种分散于DNA中，多被甲基化修饰；另一种是CpG结构过度聚集的CpG岛，后者常以非甲基化状态存在于启动子区间。在正常细胞中，跨越启动子区域的CpG二核苷酸大多未甲基化，而异常的DNA甲基化可导致基因表达的转录沉默。

DNA甲基化在基因表达、基因印记、胚胎发育等多种生物学过程中起着至关重要的作用，而甲基化DNA的过表达与各种癌症密切相关。在肿瘤抑制基因启动子区域的肿瘤类型特异性高甲基化已经被观察到，并与癌症亚型相关。在哺乳动物中，DNA甲基化几乎只发生在CpG二核苷酸中，DNA甲基转移酶催化甲基从s-腺苷蛋氨酸转移到胞嘧啶。因此，如何能够利用传感器便捷快速地通过读出电信号变化的方式来判断甲基化转移酶是否存在，这对于本领域技术人员而言将是前瞻性的。

发明内容

本发明提供了一种石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用，该传感器可便捷快速地判断甲基化转移酶是否存在，并可以定性、定量的方式实现对甲基化转移酶的识别。

为了达到上述目的，本发明提供了一种石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用，包括以下步骤：

对金电极进行清洁预处理；

将核苷酸序列固定在金电极上并用巯基己醇对核苷酸序列未与金电极结合部分进行封闭，得到固定有核苷酸序列的金电极；

将所得固定有核苷酸序列的金电极进行甲基化敏感型限制性核酸内切酶处理，利用末端转移酶延伸，并浸入含有氧化石墨烯的缓冲液中充分作用，得到石墨烯修饰的电化学生物传感器。

在上述步骤中，限制性内切酶是序列特异性的DNA酶，其通过将未受保护的入侵DNA裂解成小片段来阻止外源DNA在细菌细胞中的表达。上述步骤中使用的是甲基化敏感的限制性核酸内切酶，其特异性识别5'-CCGG-3'序列。当识别位点中存在甲基化核苷酸时，则不会被甲基化敏感的限制性核酸内切酶识别。

末端脱氧核糖核酸转移酶催化探针DNA的3'-OH端，实现DNA的生长，并得到生长产物长单链DNA，该催化作用不需要模板，具有制备工艺极其简单、设计灵活和多功能应用等特点。

氧化石墨烯是一种单原子厚度的二维碳材料，具有导热系数高、机械强度强、电子输运性能好、表面积大等优异特性。氧化石墨烯可以吸附单链DNA，吸附氧化石墨烯的单链DNA修饰电极相比于未吸附氧化石墨烯的单链DNA修饰金电极，其电极阻抗发生明显变化。

作为优选，所述核苷酸序列为含有CpG序列5'-CCGG-3'，且所述核苷酸序列两端修饰有巯基。

作为优选，将核苷酸序列固定在金电极上并用巯基己醇对核苷酸序列未与金电极结合部分进行封闭具体为：