[发明专利]一种壳寡糖单体的制备方法

说明书

本发明公开了一种壳寡糖单体的制备方法。本发明对壳寡糖溶液进行预处理，使高浓度的壳寡糖溶液在80～90％乙醇溶液中分级沉淀，高聚合度壳寡糖被沉淀下来，小聚合度壳寡糖留存在上清液中，沉淀进行第二次处理，两次得到的上清液合并，旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥，得到聚合度1～5含量高的壳寡糖粗品。再进行阳离子交换色谱分离，采用阶段性等度洗脱，一个洗脱液浓度只洗脱一个聚合度壳寡糖，实现分离过程无需检测，得到壳寡糖单体的纯度达到90％以上，产量达到克级别。

技术领域

本发明涉及一种壳寡糖单体的制备方法，属于壳寡糖制备技术领域。

背景技术

研究壳寡糖功能活性采用壳寡糖混合物作为实验原料，其聚合度分布无规律且分子量、脱乙酰度不固定，从而导致壳寡糖吸收形式、跨膜转运类型及特征和壳寡糖功能活性等颇具争议，某些研究结果甚至出现相悖的情况，极大限制其生理活性的深入研究。目前关于壳寡糖单体的制备常用的方法有凝胶色谱层析、固定金属亲和色谱层析和离子交换色谱层析三种。凝胶色谱层析受其分离原理的限制，上样量小、流速慢、分离纯度低；固定金属亲和层析需要自己设计合成色谱机制，一般采用铜离子与壳寡糖的氨基之间的相互作用，只能分离2、3、4糖，4糖以上形成的复合物稳定，不能脱离；离子交换色谱层析的上样量取决于柱体积、流速快、分离纯度高但是需要除酸除盐。因此制备高产量、高纯度壳寡糖单体是依旧是一大难点，也是进一步研究其吸收代谢机制、发挥功能活性机理的基础。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种壳寡糖单体的制备方法。本发明使用简单的乙醇分级沉淀的方法对市面上购买的分子量900Da的壳寡糖进行原料预处理，提高壳寡糖粗品中1～5糖的含量。使用阳离子交换色谱的基础上，采用阶段性等度洗脱，一个梯度洗脱液洗脱一个聚合度糖，可以最大程度的保证各个聚合度的回收率、纯度和产量。

本发明的第一个目的是提供一种壳寡糖单体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将壳寡糖溶解后得到壳寡糖溶液，向壳寡糖溶液中加入乙醇进行分级沉淀处理，收集上清液，并将沉淀溶解后加入乙醇进行第二次分级沉淀处理，合并两次上清液，浓缩干燥得到壳寡糖粗品；

(2)将壳寡糖粗品加水溶解后，上样至阳离子交换树脂，使用不同浓度的盐酸溶液进行阶段性等度洗脱，依次得到壳1糖、壳2糖、壳3糖、壳4糖和壳5糖的洗脱液；其中，不同浓度的盐酸溶液依次为0.1～0.3mol/L HCl溶液、0.3～0.4mol/L HCl溶液、0.55～0.7mol/LHCl溶液、0.85～1.0mol/L HCl溶液和1.15～1.5mol/L HCl溶液；

(3)将洗脱液分别进行中和、脱盐后，干燥得到壳寡糖单体。

进一步地，步骤(1)中，壳寡糖溶液中壳寡糖质量分数为10～30％。

进一步地，步骤(1)中，所述乙醇为无水乙醇，与壳寡糖溶液的体积比为4～5:1。

进一步地，步骤(1)中，分级沉淀是在加入乙醇后，在0～4℃静置约1～15h，然后离心收集上清液。

进一步地，所述的离心是在8000～12000r/min离心10～30min。

进一步地，所述的阳离子交换树脂为大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，上样时，壳聚糖粗品溶液中壳聚糖的质量分数为0.5～2％。

进一步地，上样采用500～700mL/h的流速上样，用去离子水洗脱到pH为5～6。

进一步地，步骤(3)中，所述的中和是用4～6mol/L NaOH溶液调节pH为8～9。

进一步地，步骤(3)中，所述的脱盐是采用活性炭萃取脱盐，具体包括如下步骤：中和后加入活性炭，搅拌2h以上，抽滤，洗涤活性炭2～3次，洗涤后将活性炭放在pH为1～3的40～60％乙醇溶液中，搅拌12h以上，抽滤，得到含壳寡糖单体的乙醇溶液。