[发明专利]一种定量检测PML-RARA融合基因的引物、探针及其试剂盒

说明书

本发明提供了一种定量检测PML‑RARA融合基因的引物、探针及其试剂盒。具体地，本发明公开了一种定量检测急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocytic leukemia，APL)中PML‑RARA融合基因长型(L型、bcr1)和短型(S型、bcr3)转录水平的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。具有实验过程操作简单、灵敏度高、特异性好等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种定量检测PML-RARA融合基因的引物、探针及其试剂盒。

背景技术

白血病，也称作血癌，是造血干细胞的恶性克隆性疾病。白血病细胞在骨髓产生，再散布到血液及全身。根据国外统计，白血病约占肿瘤总发病率的3％左右，是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。对我国的白血病发病情况调查结果显示：白血病的年发病率为2.76/10万，在所有白血病中，急性髓系白血病发病率最高(1.62/10万)，急性淋巴细胞白血病次之(0.69/10万)，慢性髓系白血病第三(0.36/10万)。在急性髓系白血病各亚型之中，M2a型、M3型、M5型发病率较高，分别为25.2％、18.7％、23.2％。

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是一种特殊类型的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)，占同期AML的10％－15％，发病率约0.23/10万^[1]。据统计，国内APL发病率高于西方国家10％左右，占AML的18.7％，部分地区如东北油田的发病率则高达20％-30％，因此，APL存在年龄、种族与地域的差异。

目前，APL的病因尚不明确，但随着分子生物学、细胞遗传学等学科的快速发展，人们对APL的分子生物学发病机制有了较深的了解。98％以上的APL患者具有特异性染色体易位t(15；17)(q22；q21)，易位的结果导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因(PML)和17号染色体上的视黄酸受体α(RARα)形成PML-RARA融合基因，其蛋白产物导致细胞分化阻滞和凋亡不足，是APL发生的主要分子机制。根据PML基因断裂点的不同，产生不同长度的PML-RARA融合基因转录本，分别为长型(L型)、短型(S型)和变异型(V型)，分别约占55％、40％和5％。PML-RARA融合基因一方面通过抑制参与早幼粒细胞髓系分化基因的转录，另一方面促进白血病细胞的生长及增殖，使得骨髓中早幼粒细胞的恶性堆积，最终诱发白血病的发生。

临床上通过检测PML-RARA融合基因是诊断APL的最特异、敏感的方法之一，也是APL治疗方案选择、疗效分析、预后和复发预测最可靠的指标。在患者治疗期间建议每2～3个月通过定量PCR监测PML-RARA转录水平进行1次分子学反应评估，持续监测2年已被列入国内外APL诊疗推荐或指南。

目前PML-RARA融合基因常用的检测包括荧光原位杂交技术(FISH)、免疫分型、实时定量PCR技术(RQ-PCR)和数字PCR等检测方法。

(1)荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization)，简称FISH，是通过荧光素标记的DNA或RNA探针与细胞核内的靶核酸序列杂交，从而获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。荧光原位杂交探针类型多种，适用样本来源广泛。FISH计数只需分析间期细胞，不受是否分裂的影响，特异性和重复性好，但由于FISH检测的实验操作复杂，对于染色体异位隐蔽的位点较难检出、易出现假阴性的结果，其次，FISH检测灵敏度低，对于微小残留病的定量追踪不够，使其在临床的应用受到很大限制。