[发明专利]一种靶向削减耐药基因blaTEM 在审
| 申请号： | 202110877460.2 | 申请日： | 2021-07-31 |
| 公开（公告）号： | CN113817731A | 公开（公告）日： | 2021-12-21 |
| 发明（设计）人： | 陈红;林泽俊;周振超;朱琳;帅馨怡 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/70;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 杭州中成专利事务所有限公司 33212 | 代理人： | 朱莹莹 |
| 地址： | 310007 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 靶向 削减 耐药 基因 bla base sub tem | ||
1.特异性靶向抗生素耐药基因blaTEM及携带blaTEM耐药质粒的gRNA，其特征在于，其编码的核苷酸序列为gRNATEM-1：5’-ATCGAACTGGATCTCAACAG-3’，gRNATEM-2：5’-ACAATTAATAGACTGGATGG-3’。
2.一种可水平转移的敲除载体pCas9-Mob，其特征在于，所述载体包含敲除蛋白基因Cas9，gRNA表达序列，水平转移位点OriT。
3.含有权利要求1所述特异性靶向耐药基因blaTEM及携带blaTEM多重耐药质粒的gRNATEM-1、gRNATEM-2的可转移型基因敲除载体pCas9-Mob-gRNATEM-1或pCas9-Mob-gRNATEM-2。
4.一种构建权利要求3所述的基因敲除载体pCas9-Mob-gRNATEM-1或pCas9-Mob-gRNATEM-2的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据权利要求1所述的gRNATEM-1和gRNATEM-2序列设计退火引物，分别为：
gRNATEM-1正向引物：5’-AAACATCGAACTGGATCTCAACAGG-3’
gRNATEM-1反向引物：5’-AAAACCTGTTGAGATCCAGTTCGAT-3’
gRNATEM-2正向引物：5’-AAACACAATTAATAGACTGGATGGG-3’
gRNATEM-2反向引物：5’-AAAACCCATCCAGTCTATTAATTGT-3’
(2)将gRNATEM-1和gRNATEM-2的正向引物和反向引物分别退火，形成双链，并用T4 PNK酶磷酸化；
(3)利用无缝克隆技术将质粒水平转移位点OriT插入pCas9质粒中，构建可转移的pCas9-Mob质粒，利用核酸内切酶将其线性化，并凝胶回收；
(4)利用T4连接酶将磷酸化后的gRNATEM-1和gRNATEM-2退火双链分别与线性化pCas9-Mob载体连接，得到的载体即为权利要求3所述的可转移型敲除载体pCas9-Mob-gRNATEM-1和pCas9-Mob-gRNATEM-2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)pCas9-Mob质粒的构建方法包括如下步骤：
(1)以pCas9质粒为模板，利用高保真PCR技术扩增复制子OriV、筛选标记基因Chl以及敲除蛋白基因Cas9序列，凝胶纯化后获得OriV-Chl-Cas9；
(2)以携带转移位点的质粒为模板，利用高保真PCR技术扩增该质粒的转移位点，凝胶纯化后获得OriT；
(3)利用无缝克隆技术连接上述纯化后的OriV-Chl-Cas9和OriT片段；
(4)将上述连接产物转化入特定大肠杆菌，该大肠杆菌染色体上整合了pCas9-Mob质粒水平转移所需要的相关基因；
(5)利用筛选标记Chl筛选出阳性克隆，将细菌扩大培养后提取质粒，该质粒即为转移型敲除载体pCas9-Mob。
6.权利要求1所述的gRNATEM-1或gRNATEM-2在抗生素耐药基因blaTEM及携带blaTEM的多重耐药质粒敲除及削减方面的应用。
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