[发明专利]一种靶向削减耐药基因blaTEM

说明书

一种靶向削减耐药基因bla_TEM及其耐药质粒的gRNA、可转移型敲除载体及其应用，本发明涉及生物技术领域，具体涉及靶向bla_TEM耐药基因及其耐药质粒的gRNA、一种可水平转移的基因敲除载体及其在bla_TEM耐药质粒削减方面的应用。本发明提供的gRNA_TEM‑1、gRNA_TEM‑2及其敲除载体pCas9‑Mob‑gRNA_TEM‑1和pCas9‑Mob‑gRNA_TEM‑2可以有效削减耐药基因bla_TEM及携带bla_TEM的多重耐药质粒。同时，利用本发明提供的敲除载体pCas9‑Mob‑gRNA_TEM‑1和pCas9‑Mob‑gRNA_TEM‑2制备方法较易得到靶向抗生素耐药基因bla_TEM的敲除载体，也为其他耐药基因的敲除及削减研究提供了有效方法和基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及靶向bla_TEM耐药基因及其耐药质粒的gRNA、一种可水平转移的基因敲除载体及其在bla_TEM耐药质粒削减方面的应用。

背景技术

近年来，随着抗生素的大量使用，越来越多的抗生素及其代谢产物被排放入污水处理系统甚至自然环境中，使得这些环境中的微生物所面临的选择性压力也日益增加。这些残留的抗生素会使得细菌不断适应并进化，进而获得抗生素耐药性。抗生素耐药性往往由耐药基因决定，这些耐药基因可位于染色体及质粒上，并通过基因垂直转移和水平转移等方式进行传播。目前，耐药基因已被视为一种新型的环境污染物。耐药基因bla_TEM在环境中普遍存在，它编码的广谱β-内酰胺酶可以使氨苄西林等β-内酰胺类抗生素水解，赋予细菌抗生素耐药性。目前，耐药基因bla_TEM在多重耐药质粒上被广泛检出，这些多重耐药质粒往往可以通过接合转移在不同种属的细菌间传播。当致病菌获得这些多重耐药质粒后，就难以被相应抗生素杀灭，进而对人类和动物产生潜在的健康风险。

目前，现有的抗生素耐药基因的削减技术往往通过改变细菌群落结构或者直接杀灭细菌，例如，通过改变环境条件使得细菌群落结构改变，从而影响多重耐药质粒的传播，或者通过消毒等杀菌手段，将细菌直接灭活，使得供体细菌难以将多重耐药质粒传播到其他细菌。然而，这些方式并未从本质上破坏多重耐药质粒，在合适的条件下，这些携带耐药基因bla_TEM的多重耐药质粒仍可以通过转化等方式进入其他细菌，继续耐药基因的传播。因此，采用CRISPR/Cas系统直接靶向敲除多重耐药质粒的削减方法可以从根本上克服这一难题。同时，利用质粒的水平转移投递敲除载体可以使敲除过程更加可持续，有利于更好的控制多重耐药质粒的迁移传播。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了靶向削减bla_TEM耐药基因及其耐药质粒的gRNA、一种可转移型敲除载体及其应用，具体包括靶向耐药基因bla_TEM的gRNA，可水平转移的敲除载体、载体构建方法及其在携带bla_TEM多重耐药质粒削减方面的应用，该技术可用于环境等领域耐药基因迁移传播的控制。

本发明的实现过程如下：

第一方面，本发明提供靶向敲除耐药基因bla_TEM及携带bla_TEM多重耐药质粒的gRNA序列，该序列如下所示：

gRNA_TEM-1：5’-ATCGAACTGGATCTCAACAG-3’

gRNA_TEM-2：5’-ACAATTAATAGACTGGATGG-3’

第二方面，本发明构建了一种可水平转移的基因敲除载体pCas9-Mob，所述载体包含敲除蛋白基因 Cas9，gRNA表达序列，水平转移位点基因，载体图谱如附图1所示。