[发明专利]一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法

权利要求书

1.一种高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从狗牙根植株剪下幼嫩叶片，刮去叶片下表皮后，将叶片撕成长条，置于培养皿中；

（2）在培养皿中加入含纤维素酶和离析酶的酶解缓冲液，抽真空使酶解缓冲液充分浸润叶片；

（3）将含酶解缓冲液和叶片长条的培养皿于黑暗避光环境中室温进行酶解；

（4）将酶解液过滤离心去除上清；

（5）采用洗涤缓冲液洗涤细胞去除残余酶液；

（6）洗涤后的细胞离心后采用维持缓冲液重悬获得原生质体细胞， 室温避光培养；

步骤（2）中酶解缓冲液配方为20 mM 吗啉乙磺酸，0.52 M甘露醇，20 mM氯化钾，10 mM氯化钙，0.1% 牛血清白蛋白，pH值为5.7；

步骤（6）中维持缓冲液配方为4 mM 吗啉乙磺酸，0.52 M甘露醇，16 mM氯化镁，pH值为5.7。

2.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤（1）中用刀片刮去叶片下表皮后，使用尖头镊子将叶片撕成宽度为0.4-0.6 mm的长条。

3.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤（2）中酶解缓冲液含质量分数2%-4% 纤维素酶和质量分数0.6%-0.8%离析酶。

4.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤（2）中抽真空时间为60分钟。

5.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤（3）中将含酶解缓冲液和叶片长条的培养皿放置于水平摇床上，于黑暗避光环境中以30-50转/分钟的低转速晃动酶解缓冲液，室温酶解6-8小时。

6.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤（4）所述将酶解液过滤离心去除上清为用吸管将三层纱布过滤后的酶解液转入圆底离心管中，以100-300 g的低速离心5-10分钟，去除上清。

7.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤（5）所述洗涤细胞去除残余酶液的方法为用吸管吸取1-2 mL洗涤缓冲液，轻轻吹吸重悬细胞，冰上静置20-40分钟。

8.根据权利要求1所述的高效分离制备狗牙根原生质体的方法，其特征在于，步骤（6）所述洗涤后的细胞离心后采用维持缓冲液重悬获得原生质体细胞的方法为将步骤（5）重悬后的细胞100-300g低速离心5-10分钟，去除上清，加入1-2 mL维持缓冲液，轻轻吹吸重悬细胞。