[发明专利]巴氏杆菌肝素骨架合酶BtHS1及其突变体与应用

说明书

本发明涉及一种巴氏杆菌肝素骨架合酶BtHS1及其突变体与应用。本发明中的肝素骨架合酶BtHS1来源于巴氏杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，同时具备乙酰氨基葡萄糖转移酶GlcNAc‑T和葡萄糖醛酸转移酶GlcA‑T两种转移酶活性。对上述巴氏杆菌肝素骨架合酶氨基酸序列的第305位进行定点突变，得到了活性更高的BtHS1突变体。本发明中的巴氏杆菌肝素骨架合酶及其突变体提高了肝素骨架合成中GlcNAc和GlcA转移合成效率，极大地促进了肝素仿生合成应用化发展，为糖胺聚糖的研究发展开启了全新的一页。

技术领域

本发明涉及一种巴氏杆菌肝素骨架合酶BtHS1及其突变体与应用，具体涉及来源于巴氏杆菌(Bisgaard Taxon)的肝素骨架合酶及其两种突变体与在肝素骨架合成中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)是一种结构复杂的生物大分子，由己糖醛酸或己糖和己糖胺组成的重复二糖单元，有规则的排列而形成的一种线性无分支的酸性多糖。糖胺聚糖分布广泛且种类繁多，根据硫酸化程度分为无硫酸修饰的糖胺聚糖和硫酸修饰的糖胺聚糖，无硫酸修饰的糖胺聚糖只有透明质酸一种，而硫酸修饰的糖胺聚糖包括硫酸皮肤素/硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素/肝素、硫酸角质素等。

肝素(Heparin，简称HP)，是一种重要的糖胺聚糖，是由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位所构成的。它因首先从肝脏中发现而得名，肝素具有增强天然丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ的活性，催化抑制内源性凝血途径的所有丝氨酸蛋白酶，因此具有抗凝血抗血栓的作用，此外还可用于治疗心绞痛、肾病综合征、严重烧伤、类风湿性关节炎等，其需求量在国际上常年处于生物技术药物领域的前列。

肝素的来源主要分为动物提取、化学合成和化学酶法合成。动物提取肝素主要是从猪和牛的小肠粘膜中提取，但由于提取方法的差异以及动物体来源的肝素的基本单元的结构，数目各不相同，导致肝素产物的结构、构型、分子量各有异同，可能引发肝素污染。此外，肝素的结构较为复杂，使用化学合成的方法延长糖链时要考虑对不稳定基团进行保护、去保护、活化和偶联等步骤，而且还要考虑区域选择性和立体选择性等情况，难度较大且产率低。HP 的化学酶法合成是化学法和酶法相结合的方法，合成过程反应条件温和，特异性强。相对于化学合成来说，该方法步骤简单，效率高。目前化学酶法合成肝素骨架糖链常用的酶有KfiA 和PmHS2等肝素骨架合酶，其中PmHS2是具有N-乙酰氨基葡糖转移酶活性和葡萄糖醛酸转移酶活性的双功能酶，在化学酶法合成中应用广泛，寻找该酶的同工酶有助于高效合成肝素骨架糖链，以及深入研究对该酶家族反应机制。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种巴氏杆菌肝素骨架合酶BtHS1及其突变体与应用，本发明中的肝素骨架合酶BtHS1来源于巴氏杆菌(Bisgaard Taxon)，并经过定点突变得到三种高活性突变体，该肝素骨架合酶及三种高活性突变体可应用于肝素骨架的合成。

术语说明：

GlcA-pNP：中文全称为4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸，其作用是作为肝素寡糖合成的起始受体底物；

UDP-GlcNAc：中文全称为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖，其作用是作为供体，为肝素寡糖的合成提供乙酰葡萄糖胺；

UDP-GlcNTFA：中文全称为尿苷二磷酸-N-三氟乙酰氨基葡萄糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，为寡糖的合成提供叠氮乙酰氨基半乳糖供体；

UDP-GalNAz：中文全称为尿苷二磷酸-N-叠氮乙酰氨基半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，为寡糖的合成提供三氟乙酰氨基葡萄糖供体；

UDP-GalNAc：中文全称为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，为寡糖的合成提供乙酰氨基半乳糖糖供体；