[发明专利]一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法

说明书

本发明公开了一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法，是通过在酿酒酵母中表达具有左旋葡聚糖激酶活性的蛋白，在酿酒酵母中建立左旋葡聚糖代谢途径，并在建立了左旋葡聚糖代谢途径的己糖转运蛋白全缺酿酒酵母重组菌株中利用表达转运蛋白Gal2p的突变体实现。同时本发明还提供了相关表达左旋葡聚糖转运蛋白Gal2p^Q341A或Gal2p^W455A和左旋葡聚糖激酶的重组酿酒酵母菌株YLGR341和YLGR455。实验证实，应用本发明提供的提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法在左旋葡聚糖的发酵中，Gal2p点突变菌株的生长与未点突变菌株相比优势明显，左旋葡聚糖利用能力明显高于未点突变菌株；其中点突变菌株YLGR341和YLGR455分别是未点突变菌株YLGR00G的3.70倍和3.72倍。

技术领域

本发明涉及一种提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法及其专用重组菌株，属于生物工程技术领域。

背景技术

木质纤维素是天然和可再生的资源，并且种类繁多来源广泛，利用木质纤维素生产燃料和化学品可以保障能源安全和减少环境污染，促进碳中和。

木质纤维素经预处理，打开纤维素、半纤维素、以及木质素之间的交联。获得的纤维素组分通常用纤维素酶水解获得葡萄糖，再加以利用。或者，纤维素还可以通过快速解热工艺，热解获得左旋葡聚糖(Levoglucosan，LG)(Jiang et al.2019)。某些微生物中存在着LG代谢途径，简单的讲，LG被左旋葡聚糖激酶(LGK)或者脱水乙酰胞壁酸激酶(AnmK)催化，生成6-磷酸葡萄糖，从而进入糖酵解途径。因此，木质纤维素原料预处理，分离获得纤维素，纤维素热解获得LG，LG被微生物代谢转化为化工产品，这样的工艺路线是可行的。例如，目前已有工作利用天然代谢左旋葡聚糖的菌株Rhodosporidium toruloides和Rhodotorulaglutinis产油脂(Lian,Garcia-Perez and Chen 2013)，Aspergillus terreus产衣康酸，Aspergillus niger产柠檬酸(Layton et al.2011)。也可以通过代谢工程策略，赋予某些不利用LG的菌株，例如大肠杆菌，利用LG的生产乙醇、苯乙烯等化学品的能力(Layton etal.2011,Lian et al.2016)。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是食品级安全的微生物，广泛地应用于食品、饮料和生物燃料的生产中，具有糖耐受性高、发酵速率高和生长旺盛等优点，但是在天然的酿酒酵母菌株中缺乏LG的代谢途径，因此不能利用LG。

Xie等从Aspergillus niger中分离纯化出了一个具有LGK活性的蛋白，并将其转入酿酒酵母中表达，并测得酶活是0.05U/mg(Xie et al.2005)。但鲜见高效利用LG生长代谢的菌株被报道。申请人推测，一方面可能酿酒酵母运输蛋白不能很好的运输LG到细胞内，另一方面可能是未找到合适的在酵母中高效表达的LGK。

酿酒酵母中有18个己糖转运蛋白，包括Hxt1p至Hxt17p和Gal2p(Reznicek etal.2015)，其中Gal2p底物广泛，可以转运半乳糖和葡萄糖，此外还对木糖和阿拉伯糖等戊糖具有一定的亲和力，适合作为候选LG运输蛋白。但经检索发现，有关显著提高酿酒酵母菌株左旋葡聚糖转运能力及利用能力的方法及其专用重组菌株还未见报道。

主要参考文献：

Chen,Y.,L.Daviet,M.Schalk,V.SiewersJ.Nielsen(2013)Establishing aplatform cell factory through engineering of yeast acetyl-CoAmetabolism.Metab Eng,15,48-54.