[发明专利]一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种脂肪干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：

(I)将脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％；

(II)收集经步骤(I)培养后的脂肪干细胞或其经传代后的脂肪干细胞的培养上清，并分离纯化得到脂肪干细胞外泌体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，培养时间均为10-14h；和/或

步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，CO₂的浓度均为5％；和/或

步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，培养温度均为37℃；和/或

步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，采用的培养基均为无血清干细胞培养基。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(I)中，将所述脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还包括如下步骤：将所述脂肪干细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(II)中，按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述脂肪干细胞外泌体：收集所述脂肪干细胞的培养上清后，先通过低速离心去除完整细胞和死细胞碎片，然后将离心上清液进行高速离心，得到脂肪干细胞外泌体沉淀；所述低速离心为4℃2000g离心8-10min；所述高速离心为4℃100000g离心90min；

进一步地，还包括将所述脂肪干细胞外泌体沉淀悬浮于PBS溶液后，使用0.45μm和0.22μm滤器先后进行过滤的步骤，所得滤液为富含脂肪干细胞外泌体的原液。

7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备得到的脂肪干细胞外泌体或富含脂肪干细胞外泌体的原液。

8.一种生发注射液，由权利要求7所述的富含脂肪干细胞外泌体的原液和注射用生理盐水配制而成；每毫升所述生发注射液中至少含有由1×10⁵个脂肪干细胞产生的外泌体；

进一步地，每毫升所述生发注射液中含有由1×10⁵个脂肪干细胞产生的外泌体。

9.如下任一应用：

P1、权利要求7所述的脂肪干细胞外泌体或富含脂肪干细胞外泌体的原液在制备权利要求8所述生发注射液中的应用；

P2、权利要求7所述的脂肪干细胞外泌体或富含脂肪干细胞外泌体的原液或权利要求8所述生发注射液在生发中的应用；

P3、权利要求7所述的脂肪干细胞外泌体或富含脂肪干细胞外泌体的原液或权利要求8所述生发注射液在组织修复中的应用。

10.如下任一方法：

方法A、一种提高脂肪干细胞增殖能力的方法，包括权利要求1-5任一中的步骤(I)，得到增殖能力提高的脂肪干细胞；

方法B、一种提高脂肪干细胞组织修复能力的方法，包括权利要求1-5任一中的步骤(I)，经步骤(I)培养后的脂肪干细胞分泌的外泌体的组织修复能力提高。