[发明专利]一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用。本发明提供了脂肪干细胞外泌体的制备方法，包括：将脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；收集培养上清，并分离纯化得到脂肪干细胞外泌体。本发明基于氧浓度梯度培养技术，极限刺激脂肪干细胞的增殖能力和应激分泌功能性外泌体的潜能，通过离心浓缩、纳米膜过滤分离富含干细胞外泌体的上清原液，最大限度保留干细胞培养上清中促进细胞生长的营养成分和活性因子，去除其他大分子蛋白、细胞碎片等难吸收成分，具有显著修复护理功效，有效改善头皮毛发再生修复的微环境。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用。

背景技术

毛发由毛干和毛根两部分组成。伸出皮肤外面的部分称为毛干，埋在皮肤内部的称为毛根。毛发缺损包括自然的雄激素性毛发脱失、烧伤性毛发缺损、创伤性毛发缺失、医源性毛发缺失等。毛发缺损的修复方法有很多：头皮扩张、头皮缩减、头皮条游离移植、皮瓣法、自体毛发移植法。此类修复方法都可以修复毛发缺失，但是，毛发移植物较大，因而产生术后毛发方向和密度分布不自然、受区损伤大、存活率低、影响美观等缺点。

外泌体(exosomes)是一种由多种细胞在正常或病理状态下分泌的微小囊泡，直径在30-150nm，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷而形成的多囊泡体，多囊泡体外膜与细胞膜融合后，通过类似出芽的方式释放到胞外基质中，具有脂质双层膜结构。外泌体内含复杂的RNA和蛋白质，在机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、细胞间信息传递、肿瘤生长和侵袭、组织稳态调控等方面发挥重要作用。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用。

第一方面，本发明要求保护一种脂肪干细胞外泌体的制备方法。

本发明要求保护的脂肪干细胞外泌体的制备方法，可包括如下步骤：

(I)将脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％(空气标准含氧量)，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％(空气标准含氧量)。

(II)收集经步骤(I)培养后的脂肪干细胞或其经传代后的脂肪干细胞的培养上清，并分离纯化得到脂肪干细胞外泌体。

其中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。

在本发明中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置具体如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。

在本发明中，所述氧气浓度均指体积百分含量。

步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，培养时间均可为10-14h(如12h)；CO₂的浓度均可为5％(体积百分含量)；培养温度均可为37℃；采用的培养基均可为无血清干细胞培养基。在本发明的具体实施方式中，所述无血清干细胞培养基具体为TheraPEAK^TMMSCGM-CD^TMMesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined(中文名称：TheraPEAK^TMMSCGM-CD^TM人间充质干细胞培养基)，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司。

步骤(I)中，将所述脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还可包括如下步骤：将所述脂肪干细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。然后再进行PBS洗涤(如洗涤两次)。