[发明专利]基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：

(1)抗孕酮单链抗体的生物淘选：采用交叉包被HT-BSA/HT-OVA完全抗原，孕酮小分子竞争洗脱，淘选条件逐渐苛刻策略进行四轮淘选；

(2)序列明确的特异性抗孕酮单链抗体：测定第四轮筛选噬菌体滴度板中阳性单克隆菌落，通过噬菌体酶联免疫分析法进一步确定噬菌体的阳性效果，通过测序进一步分析和确定最优阳性单链抗体；

(3)抗孕酮特异性单链抗体的原核表达：通过质粒提取获取噬菌粒，通过热激法将质粒转化到原核细胞，加入诱导剂进行单链抗体的原核表达。

2.根据权利要求1所述的一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述噬菌体的生物淘选策略具体按照以下步骤：以HT-OVA，HT-BSA交叉包被，四轮包被抗原浓度依次是10、1、0.1、0.1ug/mL，孕酮标准品竞争浓度依次是100、10、1、0.1ug/mL，噬菌体洗涤次数依次为10、15、20、20次，PBST中吐温20质量百分比含量依次为0.05％、0.1％、0.5％、0.5％。

3.根据权利要求1所述的一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述序列明确的特异性抗孕酮单链抗体具体按照以下步骤：用2ug/mL HT-BSA作为包被抗原，经300uL 3％脱脂奶粉封闭后，加入100uL/孔噬菌体上清液，或者加入50uL/孔适当稀释的噬菌体上清液和等体积100ug/mL孕酮标准品稀释液，再加入抗M13-HRP酶标二抗，检测吸光值；选定检测组吸光值比阴性组吸光值大于0.2以上单克隆细菌，以G-back为引物测序分析确定单链抗体的基因序列。

4.根据权利要求1所述的一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述抗孕酮特异性单链抗体的原核表达具体按照以下步骤：将2uL阳性噬菌粒pComb3x-scFv加入50uL感受态细胞E.coli TOP10F’中，冰上孵育25min，42℃水浴热激45s，迅速放回冰上并静置2min完成转化；挑取转化后单克隆接种到5mL LB培养液中，置于37℃220rpm振荡过夜，以1：1000比例将菌液加到500mL LB培养液37℃，220rpm振荡培养5-6小时后，加入IPTG终浓度为50ug/mL，30℃220rpm摇床振荡培养过夜进行诱导表达，并对通过His标签镍柱对蛋白进行提取。

5.根据权利要求4所述的一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：所述的LB培养液中含50ug/mL羧苄青霉素。

6.根据权利要求1所述的一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述孕酮标准曲线的确定具体按照以下步骤：配制浓度0，1，10，100，1000，10000，100000ng/mL的孕酮标准溶液，加入100mg/mL的单链抗体溶液作为一抗孵育；以不同浓度的孕酮标准溶液为横坐标，吸光度为纵坐标，建立四参数拟合曲线。

7.一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv，其特征在于，按照权利要求1-6所述的制备方法制得的。

8.权利要求7所述的基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv建立酶联免疫分析方法，在最优的条件下加入一系列浓度的孕酮标准品，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，建立四参数拟合曲线，使用酶标仪测定吸光值，随后用Origin分析软件。