[发明专利]基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv及其制备方法与应用

说明书

本发明一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv及其制备方法与应用，旨在提供一种利用鸡源scFv天然噬菌体展示抗体库筛选孕酮获取单链抗体的方法；该方法是通过完全抗原(HT‑OVA/HT‑BSA)交叉包被，孕酮小分子竞争洗脱策略获取明确序列的单链抗体；将已知序列的单链抗体通过热激法转化到原核细胞进行稳定表达；该抗体稳定性好，表达量高，纯度高，这为抗体的获取和生产提供一种快速、可靠的制备方法；本发明以HT‑BSA为包被抗原，孕酮小分子作为标准品，利用抗孕酮单链抗体建立竞争型酶联免疫分析方法。

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，特别涉及一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备及应用。

背景技术

孕酮，一种主要由卵巢分泌的糖皮质激素，作为常见的内分泌干扰物，对环境和人体都会造成一定危害。若检测到血清或牛奶中孕酮含量过低，牛有可能会流产，则可以通过适当补充孕酮来预防牛在怀孕早期流产，可挽回牛养殖业的巨大损失。

同时，检测牛奶制品中孕酮含量也是十分有意义的。女性儿童若长期饮用孕酮含量过高的牛奶制品，会导致性早熟，引发生理和心理各方面的问题。若检测到某品牌的牛奶制品含量过高，可避免购买该产品，减少了女性儿童性早熟的几率。所以奶制品中孕酮的检测显得尤为重要。

孕酮免疫分析快速检测技术是基于孕酮抗原和抗体的特异性结合而实现的，故抗体的制备是孕酮免疫快速检测的核心关键。传统抗体制备方法有多克隆抗体和单克隆抗体，均是通过免疫动物而制备的，但是，多克隆抗体不能保证批次与批次之间的一致性，而依赖杂交瘤细胞制备单克隆抗体这一技术生产成本高、耗时，且需要杂交瘤细胞的长期低温保存和定期驯化，但在这些过程中杂交瘤细胞会因保存条件不当，有效基因丢失或突变而无法产生有效的抗体。

随着基因工程技术的发展，序列明确的重组抗体逐渐变成研究热点，且开发具有优异性能的新型候选抗体一直是免疫测定的恒定目标。噬菌体抗体库技术的建立成为一种重组抗体的制备的替代工具。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种采用生物淘选的策略，基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，该方法采用天然鸡源噬菌，通过天然鸡源噬菌大量无线表达获取，稳定生产。

本发明提供的另外一个目的是提供一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv。

本发明提供的另外一个目的是提供上述基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的应用。

为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，依次按照下述步骤制备：

(1)抗孕酮scFv噬菌体展示文库的淘选：采用孕酮小分子竞争洗脱天然鸡源噬菌体的方法。

(2)淘选结果的评估：采用间接phage-ELISA的方法对第四轮淘选后得到噬菌体文库进行测定。

(3)特异性单链抗体阳性克隆的筛选：采用间接phage-ELISA的方法对第四轮淘选后得到噬菌体文库进行测定；

(4)阳性噬菌体的序列分析：将提取到的噬菌体粒送到公司进行测序。

(5)抗孕酮特异性单链抗体的原核表达：构建目的基因载体pComb3x-scFv，采用化学转化方法将目的载体pComb3x-scFv转到表达型感受态细胞，进行scFv蛋白的原核表达和纯化。