[发明专利]一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法

权利要求书

1.一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1:利用胚胎培养液配制成质量浓度在0.5％至3.5％的葡萄糖溶液；

S2：利用至少3对雌雄野生型斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集并挑选受精卵混匀在一起；

S3：将葡萄糖溶液及胚胎培养液分别放入6孔板中，每孔放入30枚受精卵，正常条件下培养；放入胚胎培养液中的受精卵为对照组，放入葡萄糖溶液中的受精卵为实验组；

S4：培养过程中每隔12个小时更换一次培养液，实验组继续更换葡萄糖溶液，对照组继续更换胚胎培养液；第五天开始每天更换培养液时投喂斑马鱼幼鱼饲料，并对斑马鱼生长形态进行观察，对斑马鱼幼鱼脊柱畸形率和死亡率进行统计；

S5：对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼采用活性氧荧光探针进行染色，并将染色完成的斑马鱼幼鱼用PBS缓冲液冲洗干净，放在载玻片上在荧光显微镜下观察染色情况；用吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼进行染色后，用ddH₂O将幼鱼冲洗干净，在荧光显微镜下观察幼鱼染色情况。

2.根据权利要求1所述一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1:利用胚胎培养液分别配制成质量浓度为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、3.5％的葡萄糖溶液；

S2：利用至少3对雌雄野生型斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集并挑选受精卵混匀在一起；

S3：将配制的7种浓度的葡萄糖溶液及胚胎培养液分别放入6孔板中，每孔加10ml，每孔放入30枚受精卵，每三孔为一组平行重复，正常条件下培养；放入胚胎培养液中的受精卵为对照组，放入葡萄糖溶液中的受精卵为实验组；

S4：培养过程中每隔12个小时更换一次培养液，实验组继续更换葡萄糖溶液，对照组继续更换胚胎培养液；第五天开始每天更换培养液时投喂斑马鱼幼鱼饲料，并对斑马鱼生长形态进行观察，对斑马鱼幼鱼脊柱畸形率和死亡率进行统计；

S5：对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼采用活性氧荧光探针进行染色，并将染色完成的斑马鱼幼鱼用PBS缓冲液冲洗干净，放在载玻片上在荧光显微镜下观察染色情况；用吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼进行染色后，用ddH₂O将幼鱼冲洗干净，在荧光显微镜下观察幼鱼染色情况。

3.根据权利要求1或2所述一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其特征在于，所述胚胎培养液的组成为：每升ddH₂O中含有5g的KCl、10g的Ca²⁺、2.5g的NaHCO₃及26ml甲基蓝

4.根据权利要求1或2所述一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其特征在于，步骤S3的正常培养条件为：温度控制在28.5℃；光周期为：光照/黑暗14/10小时。

5.根据权利要求1或2所述一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其特征在于，步骤S5中采用活性氧荧光探针染色的具体步骤为：对脊柱弯曲的斑马鱼先用10μM/L的活性氧荧光探针在37℃条件下染色30min，将染色完成的斑马鱼幼鱼用PBS缓冲液冲洗干净。

6.根据权利要求1或2所述一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其特征在于，步骤S5中采用吖啶橙染色液染色的具体步骤为：用浓度为400μg/L的吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼在25℃温度下进行染色30min,用ddH2O将幼鱼冲洗干净。