[发明专利]一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法

说明书

本发明公开了一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其通过将斑马鱼受精卵置于不同浓度的葡萄糖培养液中进行培育，对不同浓度的葡萄糖对斑马鱼幼鱼脊柱畸形率和死亡率进行统计，并对斑马鱼生长形态进行观察，且结合幼鱼的活性氧产生量及细胞凋亡程度等多方面考察高浓度葡萄糖的发育毒性。本发明提供了一种操作简便、评价周期短，可高效、直观地利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，不仅能对高浓度葡萄糖对斑马鱼的发育毒性进行评价，且可为高糖对其他的生物体特别是人的发育毒性的病理机制研究提供参考。

技术领域

本发明涉及毒理学检测技术领域，尤其涉及一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法。

背景技术

随着物质生活的不断丰富，妊娠合并糖尿病的发病率明显上升，危害孕妇和胎儿的健康，妊娠期糖尿病导致妊高症、早产、新生儿窒息、巨大儿的发生率明显升高。高浓度葡萄糖具有神经毒性作用，造成过多的氧自由基以及糖基化终末产物的产生，这些毒副作用对母体的健康及胎儿的早期发育都会造成巨大损害，甚至直接造成幼体的发育畸形或死亡。目前对这些高糖毒副作用的病理机制研究多采用年幼的小鼠、大鼠、兔或体外培养细胞来研究，该方法虽然得到广泛使用，但成本高、时间长、操作复杂，现象不易观察。

而斑马鱼一种原产于南亚地区的小型热带淡水鱼，由于其具有易饲养、繁殖力强，发育快，受精卵透明易观察等特点，现已成为在全世界范围内被广泛应用的脊椎实验动物。斑马鱼作为低等脊椎动物的代表，与人类基因同源性达87％，其在包括心血管系统、神经系统在内的多个重要组织器官在形态结构、生理功能及病理反应上与人类相仿，其在在发育生物学、化合物毒性评价和人类疾病模型研究等领域迅速得到广泛应用。

发明内容

因此，基于以上背景，本发明提供一种操作简便、评价周期短，可高效、直观地利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法。

本发明提供的技术方案为：

一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其包括如下步骤：

S1:利用胚胎培养液配制成质量浓度在0.5％至3.5％的葡萄糖溶液；

S2：利用至少3对雌雄野生型斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集并挑选受精卵混匀在一起；

S3：将葡萄糖溶液及胚胎培养液分别放入6孔板中，每孔放入30枚受精卵，正常条件下培养；放入胚胎培养液中的受精卵为对照组，放入葡萄糖溶液中的受精卵为实验组；

S4：培养过程中每隔12个小时更换一次培养液，实验组继续更换葡萄糖溶液，对照组继续更换胚胎培养液；第五天开始每天更换培养液时投喂斑马鱼幼鱼饲料，并对斑马鱼生长形态进行观察，对斑马鱼幼鱼脊柱畸形率和死亡率进行统计；

S5：对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼采用活性氧荧光探针进行染色，并将染色完成的斑马鱼幼鱼用PBS缓冲液冲洗干净，放在载玻片上在荧光显微镜下观察染色情况；用吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼进行染色后，用ddH₂O将幼鱼冲洗干净，在荧光显微镜下观察幼鱼染色情况。

进一步地，其包括如下步骤：

S1:利用胚胎培养液分别配制成质量浓度为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、3.5％的葡萄糖溶液；

S2：利用至少3对雌雄野生型斑马鱼(AB型)交配并产卵，收集并挑选受精卵混匀在一起；

S3：将配制的7种浓度的葡萄糖溶液及胚胎培养液分别放入6孔板中，每孔加10ml，每孔放入30枚受精卵，每三孔为一组平行重复，正常条件下培养；放入胚胎培养液中的受精卵为对照组，放入葡萄糖溶液中的受精卵为实验组；